通过单链DNA结合蛋白(SSB)内在无序连接区(IDL)的定向改造调控其相分离特性

本研究针对细菌单链DNA结合蛋白(SSB)相分离(LLPS)的分子机制这一关键科学问题，通过系统改造SSB蛋白的内在无序连接区(IDL)，揭示了IDL中甘氨酸富集区域和芳香族/带正电荷残基对相分离特性的调控作用。研究人员利用AlphaFold 3预测结构结合生物化学实验，成功实现了在不影响ssDNA结合和蛋白互作功能的前提下，对SSB相分离倾向和液滴稳定性的精准调控，为理解原核生物无膜细胞器形成机制提供了新视角。

　　

在生命活动的微观世界里，蛋白质的相分离现象如同魔法般塑造着细胞的时空组织。近年来，科学家们发现这种液-液相分离(LLPS)过程是真核细胞形成无膜细胞器的关键机制，但在原核生物中却知之甚少。大肠杆菌(Escherichia coli)的单链DNA结合蛋白(SSB)作为基因组代谢的核心组分，其新发现的相分离特性为理解细菌如何在不具备复杂内膜系统的条件下实现细胞区室化提供了重要线索。然而，SSB蛋白中决定这一神奇特性的分子"密码"仍待破译，特别是其内在无序连接区(IDL)如何协调多种相互作用来驱动相分离，这成为领域内亟待解决的科学难题。

来自匈牙利罗兰大学等机构的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的重要研究，通过精巧的蛋白质工程策略，对SSB蛋白的IDL区域进行系统性改造，揭示了控制相分离特性的关键结构特征。研究发现，在不影响ssDNA结合和RecQ解旋酶等蛋白互作功能的前提下，通过靶向修饰IDL中的甘氨酸富集区域和芳香族/带正电荷残基，可以实现对SSB相分离倾向和液滴稳定性的广泛调控。这项工作不仅阐明了IDL驱动相互作用对蛋白质相分离的贡献，更为通过基因工程手段在体内研究SSB相分离的功能意义开辟了新途径。

研究人员运用了多项关键技术：荧光偏振分析测定ssDNA和RecQ解旋酶结合能力；浊度测量和荧光显微镜观察相分离行为；竞争性结合实验评估C末端肽段(CTP)暴露程度；温度依赖性实验分析液滴稳定性；AlphaFold 3预测四聚体结构揭示分子互作模式。这些方法的有机结合为深入理解IDL的相分离调控机制提供了多角度证据。

IDL-engineered EcSSB constructs retain the capacity for binding ssDNA and RecQ helicase
通过荧光偏振实验证实，所有工程化SSB变体均保持与野生型相当的ssDNA结合能力，对36nt和79nt ssDNA的结合亲和力无显著差异。更重要的是，除完全缺失IDL的GG变体外，其他变体与RecQ解旋酶的相互作用也未受影响，表明IDL改造可特异性调控相分离而不干扰核心生物学功能。

The condensation propensity of EcSSB can be influenced in a broad range via IDL engineering
浊度测定和荧光显微观察发现，野生型SSB在生理条件下即可形成液滴，而工程化变体需要分子拥挤剂(PEG 20K)辅助。其中d1G、d2G和W136D变体表现出中等相分离倾向，而EPE和R116D-W136D则完全丧失该能力。特别值得注意的是，用恶性疟原虫SSB的IDL替换的EPE变体无法相分离，而含人源SSB1 IDL的EHE变体仅在高浓度拥挤剂下才能形成液滴。

IDL compatibility governs co-condensation of EcSSB variants
共凝聚实验揭示，野生型SSB能与缺失CTP的dC变体协同形成液滴，但与其他工程化变体存在互作障碍。特别是R116D-W136D和W136D变体强烈抑制野生型SSB的相分离，表明IDL相容性对多价相互作用网络的形成至关重要。

CTP exposure is greatly influenced by IDL structure, but does not determine condensation propensity
竞争性结合实验表明，CTP暴露程度与IDL长度呈负相关：最短的(GGS)4和GG变体CTP暴露最多，而W136D变体尽管IDL长度与野生型相同，却完全丧失CTP竞争能力。这提示IDL构象动态变化而非单纯的CTP可用性才是相分离的主要决定因素。

IDL-engineered EcSSB variants retain ssDNA regulation but show impaired stability of condensates
所有变体均保留ssDNA对相分离的化学计量抑制特性，但液滴稳定性普遍降低。温度实验显示野生型液滴最稳定(Tc最高)，d1G、d2G、W136D和dC依次降低。离子敏感性实验也证实工程化变体对Cl-和L-Arg的抑制作用更为敏感。

Enrichment of EcSSB binding partners in condensates can be retained despite impaired condensate formation
尽管相分离能力受损，W136D变体仍保持与野生型相当的伙伴蛋白(如RecQ解旋酶)富集能力，而d2G变体虽能形成较稳定液滴但伙伴富集效率降低。这表明相分离倾向与伙伴招募能力是可分离的表型，可通过IDL工程进行独立调控。

AF3 predicted tetrameric structures of EcSSB reveal versatile modes of CTP binding to the OB domain
AlphaFold 3预测发现CTP能以多种模式结合OB四聚体：主要位点S1(含F61/R85/V106等残基)与先前NMR结果一致，新发现的S2位点(含T86/Y98等)也参与相互作用。这些预测揭示了SSB四聚体作为多价弱相互作用平台的独特优势，为理解相分离的分子基础提供了结构见解。

Condensation engineering data support the development of LLPS prediction algorithms
通过系统评估七种相分离预测算法(如PSPHunter、DeePhase等)，研究发现现有方法对IDR序列变化导致的相分离倾向改变预测准确性有限，特别是难以准确评估细微序列修饰的影响。这凸显了需要更多类似本研究的实验数据集来改进预测算法。

这项研究通过对SSB蛋白IDL区域的精准改造，建立了原核生物蛋白相分离的"设计原则"：甘氨酸富集区域提供构象柔性，芳香族和带正电荷残基介导特异的IDL-IDL相互作用，而CTP的可用性则受IDL构象动态调控。这些发现不仅为在体内研究SSB相分离的生理功能提供了理想工具，更拓展了我们对蛋白质无序区域如何编码相分离信息的理解。特别值得注意的是，研究证明相分离倾向、液滴稳定性和伙伴蛋白招募是可以独立调控的表型，这一发现为开发靶向相分离的精准干预策略提供了重要理论基础。从更广泛的视角看，这项工作展示的"序列-结构-相分离行为"关系框架，将有助于解析与人类疾病相关的病理相分离现象，并为设计具有定制相分离特性的合成生物学元件开辟新途径。