Bacteroides caccae多糖利用位点组分降解硫酸软骨素的机制解析及其新型脱水酶功能重定义

本研究针对肠道菌群降解糖胺聚糖(GAGs)的分子机制未完全阐明的问题，通过解析Bacteroides caccae PUL25基因座的CAZymes功能，发现其通过PL35裂解酶、GH88外切糖苷水解酶与新型β-D-葡萄糖醛酸脱水酶(BcGDH)的级联反应降解硫酸软骨素(CS)，并证实GH154家族实为糖醛酸脱水酶，为肠道菌群-宿主糖代谢互作提供新见解。

　　

在人体肠道这个复杂的生态系统中，微生物与宿主之间持续进行着精妙的分子对话。其中，糖胺聚糖(GAGs)作为哺乳动物细胞外基质和细胞表面的重要组分，既是宿主组织的结构基础，也是肠道菌群的关键营养来源。这类线性杂多糖包括透明质酸(HA)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸角质素(KS)以及硫酸软骨素(CS)等，其降解产物短链脂肪酸(SCFA)对维持结肠健康和调节微生物组成具有重要作用。在众多肠道细菌中，拟杆菌属(Bacteroides)以其卓越的糖代谢能力著称，它们通过多糖利用位点(PUL)系统高效分解各类复杂聚糖。然而，尽管对模式菌Bacteroides thetaiotaomicron的GAG代谢研究较为深入，但其他菌种如Bacteroides caccae的降解机制仍存在大量未知。

这项发表在《Journal of Biological Chemistry》的研究由加拿大科学家团队完成，聚焦B. caccae ATCC 43185基因组中一个特殊PUL（PUL25）的功能解析。该基因座包含预测的PL35家族多糖裂解酶、GH88和GH109家族糖苷水解酶，以及一个注释为GH154家族的蛋白。研究人员通过蛋白质结晶、酶动力学分析、质谱检测等技术，系统揭示了这些酶协同降解硫酸软骨素的独特途径：首先由内切硫酸酯酶BcSulf脱硫生成软骨素(CH)，随后PL35家族裂解酶BcPL35切割生成不饱和寡糖，GH88外切酶处理非还原端Δ4,5-不饱和糖醛酸，而最关键的发现是原GH154家族蛋白实为新型β-D-葡萄糖醛酸脱水酶(BcGDH)，可通过脱水反应为GH88创造底物。

BcPL35 from PUL25 prefers chondroitin
通过荧光辅助电泳(FACE)和紫外吸收实验证实，BcPL35优先作用于经BcSulf脱硫或化学脱硫的CS-A（即软骨素），主要生成不饱和二糖(CSΔ0S)和少量四糖、六糖。晶体结构解析显示其具有(α/α)₆
环形结构域与反平行β-片层域组成的双域结构，活性位点突变体实验确认Y232和H387为关键催化残基。

BcGH88 works in tandem with BcPL35
该GH88家族成员能高效水解BcPL35产物中的Δ4,5-不饱和葡萄糖醛酸，通过耦合KduI/KduD酶系统证实其生成5-酮基-4-脱氧糖醛酸产物。动力学分析显示其对CSΔ0S和CSΔ6S的催化效率(k_cat
/K_m
)达1.3 s^-1
mM^-1
，但对HA来源二糖活性降低10倍。

BcGH109 is an α/β-N-acetylgalactosaminidase
酶活筛选显示该GH109家族蛋白特异性水解pNP-α/β-GalNAc，推测其负责切除BcGH88处理后暴露的β-1,4连接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

Identification of a novel dehydratase
原注释为GH154的蛋白（重命名为BcGDH）意外显示出脱水酶活性：通过紫外吸收和LC-ESI-MS证实其能将软骨素二糖(GlcAβ1-3GalN)的饱和葡萄糖醛酸转化为Δ4,5-不饱和形式，为GH88创造底物。晶体结构显示其形成稳定的四聚体，活性位点保守残基突变体均丧失活性。

Structural analysis of BcGDH
R285A突变体与软骨素二糖的复合物结构揭示了催化机制：Y289作为酸催化O4质子化，Y229作为碱夺取C5质子，R285则稳定中间体氧负离子。这种双酪氨酸机制与鞘氨醇单胞菌的藻酸裂解酶Alg17C相似。

这项研究的意义在于首次完整描绘了B. caccae降解硫酸软骨素的级联反应途径，特别是发现了GH154家族蛋白的真实功能为糖醛酸脱水酶。这一发现不仅修正了CAZy数据库的分类错误，更揭示了肠道菌群分解GAGs的新策略——通过脱水酶与外切糖苷水解酶的协同作用实现高效代谢。鉴于B. caccae在高脂高糖饮食人群肠道的富集现象，其独特的PUL25系统可能成为调控肠道菌群-宿主代谢互作的新靶点。此外，GH154家族功能的重新定义将为预测其他含糖醛酸聚合物的代谢途径提供重要参考，这对理解肠道微生物生态位分化、开发基于GAG的益生元具有重要意义。