基于离心萃取与分配色谱技术的E. coli生物工厂代谢物高效分离及新型羟基酪醇衍生物发现

本研究针对微生物合成羟基酪醇(HT)下游分离效率低、传统方法溶剂用量大等问题，开发了整合环形离心萃取(ACE)与离心分配色谱(CPC)的创新工作流程。研究人员通过代谢工程改造E. coli生物工厂，结合HRMS/MS和2D NMR技术，首次实现23种HT代谢物的直接分离鉴定，为天然产物生物合成路径优化提供了高效可扩展的技术方案。

　　

在天然产物研究领域，羟基酪醇(HT)因其卓越的抗氧化活性和广泛的心血管保护、抗肿瘤等药理作用备受关注。然而传统从橄榄中提取HT面临产量低、成本高的困境，而化学合成又存在重金属污染和步骤繁琐等问题。虽然利用E. coli等微生物工厂进行生物合成展现出前景，但下游分离纯化过程始终存在瓶颈——复杂的发酵液成分导致HT回收率低下，传统固相色谱法溶剂消耗大，且难以区分结构相似的代谢物。

针对这些挑战，欧洲研究团队在《Journal of Chromatography A》发表的研究中，开创性地将两种离心分离技术引入生物技术工作流。该研究首先通过代谢工程构建了以L-酪氨酸为前体的E. coli HT生产菌株，随后采用环形离心萃取(ACE)进行培养基初提，利用泰勒-库埃特流效应实现高效液-液萃取；继而运用离心分配色谱(CPC)基于化合物在两相溶剂系统中的分配系数(K_D
)差异进行精细分离。结合高分辨质谱(HRMS/MS)和二维核磁共振(2D NMR)技术，建立了从生产到结构解析的完整技术链条。

关键技术方法
研究团队采用环形离心萃取(ACE)处理发酵液，利用离心力场中的涡流增强混合效率；通过离心分配色谱(CPC)在无固相载体条件下实现克级制备分离；运用HRMS/MS进行代谢物筛查，结合¹
H-¹³
C HSQC等2D NMR技术完成新衍生物结构鉴定。

研究结果

材料与试剂
建立基于乙酸乙酯-甲醇-环己烷-水的多相溶剂系统，优化CPC分离参数。

结果与讨论
• ACE处理使HT提取效率提升3倍，溶剂用量减少40%
• CPC分离获得23个化合物，包括5种新型HT糖苷化衍生物
• NMR分析揭示L-酪氨酸→L-DOPA→多巴胺→HT的完整生物合成路径
• 发现3个K_D

10的高极性代谢物，拓展了HT衍生物化学空间

结论
该研究首次将ACE-CPC联用技术应用于微生物代谢物分离，解决了生物工厂产物极性范围广、浓度低的分离难题。通过HRMS/MS与2D NMR联用策略，不仅验证了已知HT合成途径，还发现了涉及糖基转移的新型修饰反应。该方法为天然产物生物合成研究提供了可放大的绿色分离方案，其技术框架可扩展至其他高附加值酚类化合物的生产。

讨论意义
研究团队特别强调，液体-液体离心技术避免了固相载体造成的样品损失，对热不稳定化合物保留率超过95%。CPC处理10L发酵液仅需8小时，显著优于传统层析方法。该工作为微生物工厂的工业化应用扫除了下游处理障碍，同时为代谢途径优化提供了实时监测工具。作者指出，发现的新型HT衍生物其生物活性尚待评估，这可能开辟抗氧化剂药物开发的新方向。