单细胞分离揭示口腔鳞癌中5-氟尿嘧啶耐药亚克隆：靶向肿瘤干细胞特性与上皮-间质转化的新策略

为解决口腔鳞癌(OSCC)化疗耐药难题，研究人员通过微流控单细胞分离技术获得5-氟尿嘧啶(5FU)耐药亚克隆Holoclone/Meroclone/Paraclone，发现其通过上调ABCB1/ABCG2转运体、增强OCT4/SOX2等肿瘤干细胞(CSC)标志物表达及EMT转化（E-cadherin↓ /Vimentin↑ ）获得迁移侵袭能力，为靶向多重耐药通路提供新思路。

　　

口腔鳞状细胞癌(OSCC)作为头颈部最常见的恶性肿瘤之一，其治疗面临严峻挑战。尽管手术、放疗和化疗技术不断进步，但患者仍常遭遇复发和转移的困境。5-氟尿嘧啶(5FU)作为化疗基石药物，其疗效常因肿瘤细胞产生耐药性而大打折扣。更棘手的是，这种耐药性可能源于肿瘤内部的异质性——不同亚克隆细胞通过不同机制逃逸药物杀伤。那么，这些耐药细胞如何产生？它们具有哪些共同特征？又该如何针对性消灭它们？这些问题的解答对改善OSCC治疗至关重要。

为揭开这些谜团，来自中国台湾的研究团队在《Journal of Dental Sciences》发表了一项创新研究。他们采用微流控单细胞分离技术，从5FU耐药的SCC25细胞系中成功分离出三种形态和功能各异的亚克隆，并系统分析了其耐药机制与恶性特征。研究发现，这些亚克隆不仅通过上调ABC转运蛋白(ABCB1/ABCG2)增强药物外排能力，还同时具备肿瘤干细胞(CSC)特性（OCT4/SOX2高表达、CD44⁺
/CD133⁺
表型）和上皮-间质转化(EMT)特征（E-cadherin^↓
/Vimentin^↑
/Twist^↑
），最终导致更强的迁移侵袭能力。这一发现为开发同时靶向多重耐药通路的联合治疗策略提供了理论依据。

研究主要采用了几项关键技术：通过脉冲式5FU暴露构建耐药细胞模型；利用CellGem?微流控系统进行单细胞分离与克隆培养；采用3D微球体培养(CellHD256?系统)模拟肿瘤微环境；结合RT-qPCR、Western blot和流式细胞术分析耐药与干细胞标志物；Transwell实验评估迁移侵袭能力。

研究结果

1. 耐药亚克隆的建立与形态特征：通过间歇性5FU暴露成功诱导耐药性，微流控分离出Holoclone（致密克隆）、Meroclone（混合形态）和Paraclone（松散克隆）三种亚型，其形态与亲本细胞显著不同，提示获得间质样特征。

2. 3D培养下的耐药异质性：所有亚克隆在3D培养中表现出更强耐药性，其中Holoclone和Paraclone的ABCB1/ABCG2表达最高，提示药物外排是主要耐药机制之一。

3. CSC特性分析：耐药亚克隆尤其是Holoclone和Paraclone高表达干细胞核心因子OCT4/SOX2，且CD44⁺
   /CD133⁺
   细胞比例超过99%，证实其具有强自我更新和肿瘤起始潜能。

4. EMT与转移能力：耐药亚克隆呈现典型EMT转变——E-cadherin表达降低而Vimentin和Twist升高，Transwell实验证实Holoclone和Paraclone的迁移侵袭能力显著增强。

结论与意义
该研究首次在单细胞层面揭示了OSCC中5FU耐药亚克隆的异质性图谱，证明耐药性、干细胞特性和EMT进程三者存在紧密关联。特别值得注意的是，Holoclone和Paraclone同时具备ABC转运蛋白过表达、CSC标志物阳性及EMT特征，这种"三位一体"的耐药模式解释了为何单一靶向治疗往往收效甚微。

从转化医学角度看，这项研究提出了突破性的治疗思路：针对高耐药性亚克隆，需开发同时抑制ABC转运体（如使用维拉帕米等拮抗剂）、阻断干细胞信号通路（如OCT4/SOX2抑制剂）和逆转EMT（如Twist抑制剂）的"鸡尾酒疗法"。此外，研究中建立的微流控单细胞-3D培养整合平台，为未来快速评估患者个体化耐药谱提供了技术储备。这项成果不仅为OSCC精准治疗开辟新路径，其揭示的耐药共性机制也可能推广至其他上皮源性肿瘤的研究中。