成人感觉神经元基因沉默高通量筛选平台的开发与优化：一种低成本高灵敏度的神经再生研究新工具

本研究针对成年感觉神经元基因功能研究中转染效率低、成本高的技术瓶颈，开发了基于384孔板的脂质体siRNA筛选平台。研究人员通过系统优化培养板材质、转染试剂比例等参数，在Fischer 344大鼠DRG神经元中实现EGFP表达量降低≥50%（45%神经元），平均敲除效率达60%，同时保持神经突长度不受影响。该技术使单孔试剂成本降低12倍，操作时间从2天缩短至3小时，为神经再生机制研究提供了首个经济高效的成人神经元高通量筛选方案。

　　

在神经科学领域，成年感觉神经元作为研究神经再生的黄金模型，长期面临基因操作的技术困境。传统电转染和病毒转导虽有效但成本高昂，而常规脂质体转染在终末分化的神经元中效率低下。这种技术壁垒严重阻碍了从海量组学数据中筛选神经再生关键靶点的进程。针对这一挑战，来自VA San Diego Healthcare System等机构的研究团队在《Journal of Neuroscience Methods》发表重要成果，开发出首个专为成年感觉神经元优化的高通量基因沉默筛选平台，通过创新性的双报告系统设计，实现了低成本、高效率的基因功能研究。

研究采用Fischer 344-Tg(UBC-EGFP)转基因大鼠的背根神经节(DRG)神经元，通过系统比较不同品牌384孔板的神经突生长特性，优化脂质体/siRNA比例等关键参数。核心技术包括：1）基于EGFP荧光强度的转染效率定量分析；2）βIII-tubulin免疫荧光标记的自动化神经突形态追踪；3）Lipofectamine2000与RNAiMAX转染试剂的平行比较；4）层粘连蛋白(Laminin)和硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)的动态范围调节实验。

【2.1. Differences in 384-well Plate Manufacturing Directly Influences Neurite Morphology of Adult DRG Neurons】
研究发现不同厂商的384孔板对神经突形态产生惊人影响：Matrix品牌使神经突长度增加100%，而Matrical品牌则减少30%。这种由培养板表面特性引起的差异提示实验材料选择对神经科学研究的重要性，最终研究选定表现居中的Nunc品牌进行后续实验。

【2.2. Stimulatory and Inhibitory Substrates Can be Utilized to Alter Neuronal Morphology】
通过剂量响应实验确定层粘连蛋白(EC₅₀
=5 μg/ml)和CSPGs(IC₅₀
=15 μg/ml)的最佳作用浓度，建立了可调控的神经突生长动态范围系统，为筛选促再生基因提供了灵敏的检测窗口。

【2.3. Titration of Transfection Reagent】
关键优化显示0.12 μL/well的转染试剂可在保证神经元存活的前提下实现最大EGFP沉默效果。浓度超过此阈值会导致神经突长度显著减少，揭示出转染毒性阈值的存在。

【2.5. Optimized Screening Conditions】
在最优条件下，45%的神经元实现≥50%的EGFP表达降低，最高达60%，这一效率远超既往报道的成人神经元转染水平。

【2.6. PTEN mRNA Silencing Significantly Increases Axon Growth】
验证实验证实PTEN siRNA使神经突生长增加40%，而细胞死亡相关siRNA则减少30%，证明该平台能可靠检测基因调控的神经突形态变化。

这项研究通过多重技术创新，成功解决了成人神经元基因操作的历史性难题。其核心价值在于：1）首次建立成人DRG神经元的高通量筛选标准流程；2）开发EGFP/βIII-tubulin双报告系统实现同步监测转染效率与表型变化；3）发现培养器材表面对神经突生长的重大影响；4）使单基因筛选成本降至20美元以下。该平台特别适用于验证神经再生相关组学研究发现的候选基因，其模块化设计也便于整合新型转染技术。研究提供的详细protocol（包括厂商信息、浓度梯度等）显著提升了方法的重现性，为中小实验室开展神经基因功能研究提供了可行方案。这些突破不仅加速了神经再生机制的解析，也为其他终末分化细胞的高通量研究提供了重要参考。