生物能量应激通过氧化损伤和严谨反应双重机制加剧抗生素耐药性与持留性

这项研究揭示了细菌在生物能量应激（bioenergetic stress）状态下，通过增强活性氧（ROS）介导的DNA损伤和严谨反应（stringent response）激活，加速抗生素耐药性（AMR）进化和持留性（persistence）形成的分子机制。研究人员通过合成生物学手段构建ATP水解（pF1）和NADH氧化（pNOX）模型，结合代谢组学、基因组规模代谢模型（iML1515）和实验室进化实验，首次证明能量代谢失衡通过提高突变率和诱导休眠状态，成为抗生素治疗失败的潜在驱动因素。该发现为开发靶向细菌能量稳态的联合疗法提供了新思路。

　　

抗生素耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，每年导致数百万人死亡。尽管已知抗生素会引发细菌代谢紊乱，但能量代谢失衡如何直接影响耐药性演化仍不清楚。传统观点认为，持留菌（persister cells）作为代谢休眠的亚群，通过暂时耐受抗生素为耐药突变积累提供"温床"。然而，美国罗格斯大学Jason H. Yang团队在《Nature Communications》发表的研究颠覆了这一认知，揭示活跃代谢状态下的能量危机同样能促进耐药性发展。

研究人员采用合成生物学策略，构建了持续消耗ATP（pF1质粒）或NADH（pNOX质粒）的大肠杆菌模型，模拟抗生素诱导的生物能量应激（ATP/ADP比值和腺苷酸能荷AEC降低）。通过整合液相色谱-质谱（LC-MS/MS）代谢组学、Seahorse能量代谢分析仪、基因组规模代谢模型（iML1515）和实验室进化实验，结合Luria-Delbrück波动试验和荧光报告系统，系统解析了能量应激对抗生素效价的影响机制。

主要技术方法

1. 构建ATP水解酶（atpAGD）和NADH氧化酶（nox）的合成生物学模型
2. 采用LC-MS/MS定量分析能量代谢物（ATP/ADP、NADH/NAD⁺
   ）
3. 应用iML1515基因组规模代谢模型预测代谢通量变化
4. 通过实验室进化实验监测环丙沙星耐药性发展
5. 利用S2 (p)ppGpp生物传感器和流式细胞术检测严谨反应激活

Bioenergetic stress enhances antibiotic resistance evolution and persistence
研究发现16 ng/mL环丙沙星处理1小时即可显著降低ATP/ADP比值（p=0.0335）和NADH/NAD⁺
（p=0.0807）。pF1和pNOX菌株分别表现出2.3倍和1.8倍加速的耐药性进化（p<0.05），同时持留菌比例提高10-100倍。代谢模型预测显示，能量应激菌株的ATP合成酶活性增加1.8倍（p<0.0001），超氧化物产生量提升2.1倍。

Bioenergetic stress induces oxidative DNA damage
ELISA检测证实能量应激菌株8-氧代脱氧鸟苷（8-oxo-dG）水平升高3.5倍（p<0.0001），但基础突变率不变。有趣的是，在亚抑制浓度环丙沙星（8 ng/mL）下，应激菌株的应激诱导突变率显著增加（p=0.0013），提示能量失衡通过环境依赖方式促进基因组不稳定性。

Bioenergetic stress accelerates resistance evolution via enhanced ROS production
呼吸缺陷菌株（ΔETC）和过氧化氢酶处理实验证明，ROS是加速耐药性进化的必要条件（p<0.0001）。ATP合成酶抑制剂piceatannol可阻断这一过程，表明氧化磷酸化耦合的呼吸链活性是关键媒介。

Bioenergetic stress-enhanced persistence requires the stringent response
严谨反应缺陷株（ΔrelAΔspoT）完全消除了能量应激介导的持留性（p<0.01）。但令人意外的是，稳态条件下(p)ppGpp生物传感器S2未检测到严谨反应激活，提示这种保护机制需要抗生素触发的动态能量失衡。

Bioenergetic stress is needed for enhanced persistence in highly respiring cells
培养基切换实验揭示，从营养丰富培养基突然转换到贫瘠培养基（模拟临床治疗时的营养剥夺）可使高呼吸活性菌株的持留率提高100倍，而反向转换则消除该效应，证实能量供需失衡的瞬时变化是持留性诱发的决定性因素。

讨论与意义
该研究建立了"能量稳态失衡-代谢重组-遗传不稳定性/休眠"的抗生素耐药性发展新范式。发现即使在高代谢活性状态下，只要ATP消耗超过合成能力（如抗生素治疗初期），细菌仍能通过严谨反应进入保护状态。这解释了为何某些活跃感染的细菌难以被清除，也为联合靶向策略提供了新靶点：如同时抑制ATP合成酶（如bedaquiline）和阻断严谨反应可能克服持留性。研究还提示，宿主微环境（如缺氧、营养限制）可能通过加剧病原体能量应激而无意中促进耐药性进化，这对结核病等慢性感染的治疗具有重要启示。

这项工作的创新性在于：首次直接证明能量应激本身可作为选择压力驱动耐药性；发现代谢活跃状态也能产生持留性；阐明能量传感与DNA损伤修复的分子偶联机制。这些发现为理解临床抗生素治疗失败提供了新视角，并将能量代谢调控确立为抗耐药策略开发的新方向。