膜联蛋白介导的膜招募与超声处理实现蛋白质/DNA复合物单层脂质体封装新策略

本文报道了一种创新性方法，通过膜联蛋白A4（Annexin A4）介导的钙依赖性膜招募和温和超声处理，将天然蛋白质/DNA复合物（TFAMoplex）高效封装至单层脂质体（LUVs）中。该技术突破传统有机溶剂依赖的局限，在生理缓冲条件下实现约40%的封装效率，为构建合成生物系统（121 nm平均流体直径）和基因递送平台提供新思路。

　　

膜联蛋白介导的膜招募与超声处理实现高效封装

Motivation
生命体与病毒的基本蓝图均以DNA或RNA为载体，这些遗传物质由特定酶系统调控并被脂膜包裹。实现DNA-蛋白质复合物在单层囊泡中的高效共封装，是开发生命模拟系统和病毒样载体的关键步骤。现有技术多依赖高浓度核酸/蛋白质或有机溶剂，可能破坏天然蛋白质构象。本研究旨在建立一种在稀释水相条件下操作的封装策略，为构建复杂生物系统提供新方法。

Highlights
• 膜联蛋白A4（Annexin A4 T7D突变体）实现钙离子依赖的膜招募机制
• 超声处理可将复合物涂层巨型单层囊泡（GUVs）转化为121 nm单层脂质体（LUVs）
• 约40%的TFAMoplex在囊泡内获得核酸酶保护
• 该方法在生理水相条件下完成DNA/蛋白质共封装

Summary
本研究开发出无需有机溶剂、采用天然脂质在生理缓冲液中封装天然蛋白质/DNA复合物的创新方案。人类线粒体转录因子A（TFAM）与质粒DNA（pDNA）形成纳米级复合物（TFAMoplex），通过膜联蛋白A4介导的钙依赖性膜结合作用，使复合物富集于预形成的GUVs表面。经短脉冲超声处理，成功将TFAMoplex封装至单层脂质体中，平均封装效率达40%，平均流体动力学直径121 nm。这种基于人类蛋白质功能的策略，为生物医学应用开辟新途径。

Introduction
脂质体作为由磷脂双分子层构成的稳定隔室，在药物递送和合成生物学领域具有重要价值。传统DNA封装技术多依赖阳离子脂质形成脂质体-DNA聚集体（lipoplexes），但其高电荷密度和疏水区域不利于维持蛋白质天然构象。本研究突破技术瓶颈，通过三重创新策略：1）TFAM介导的DNA纳米压缩（~100 nm）；2）膜联蛋白A4驱动的膜表面富集；3）GUVs超声转化技术，实现生理条件下高效封装。

Results
TFAM-膜联蛋白A4促进钙依赖性膜招募
实验证实重组膜联蛋白A4（EGFP-A4）仅在含阴离子脂质DOPS和1 mM CaCl₂
条件下，15分钟内即可特异性结合GUVs膜表面。TFAMoplex-A4复合物（流体直径97-111 nm）展现相同膜招募特性，通过碘化丙啶染色直观显示DNA的膜定位。

短脉冲超声实现GUVs向LUVs转化
优化实验表明，3次1秒超声脉冲可在控制DNA降解（保留68%完整性）的同时，有效将GUVs转化为100 nm级囊泡。动态光散射（DLS）证实处理后的样品主要含121 nm单分散颗粒（PDI=0.23）。

膜结合TFAMoplex-A4的高效封装
冷冻电镜显示超声处理后囊泡呈典型单层结构，内部可见颗粒状封装物质。DNase保护实验证实约40% DNA获得囊泡内保护，纳米流式检测（nanoFCM）显示钙离子依赖组双阳性（Cy5+/FITC+）颗粒占比达35%。

Discussion
相较于传统脂膜水化法（0.3%-10%效率）或乙醇/钙法（65%-70%效率但破坏蛋白），本方案在生理条件下实现显著进步。膜联蛋白对负曲率膜的偏好可能促进封装过程，而GUVs的大扁平表面比小囊泡更利于高效封装。该技术为基因递送系统开发提供新思路，未来通过整合膜融合蛋白可进一步提升胞质递送效率。

Limitations of the study
当前GUVs制备工艺对囊泡尺寸控制有限，可能影响封装效率。膜联蛋白构建体的免疫原性和囊泡体内稳定性等应用瓶颈仍需突破。这些限制为后续研究指明优化方向。