利什曼原虫RNA合成在阶段转换中呈组成型：全基因组PRO-seq分析揭示基因表达调控新机制

这篇研究通过全基因组精度核运行测序（PRO-seq）技术，首次系统证实杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）在昆虫期（前鞭毛体）和哺乳动物期（无鞭毛体）的RNA合成均为组成型（constitutive），不受环境诱导或生命周期阶段转换影响。研究发现转录起始于链转换区（dSSR），终止于收敛链转换区（cSSR），且染色体非整倍性（aneuploidy）通过基因拷贝数调控表达水平，为理解寄生性原生动物独特的转录后调控机制提供了关键证据。

　　

ABSTRACT
杜氏利什曼原虫作为黑热病的病原体，其基因表达调控长期被认为以转录后机制为主。研究采用精度核运行测序（PRO-seq）技术，首次在全基因组尺度比较了前鞭毛体、无鞭毛体及HSP90抑制剂radicicol诱导的类无鞭毛体阶段的转录动态。结果显示：所有染色体上的多顺反子转录单元（PTU）均呈现单向转录特征（5′→3′链覆盖度34 reads vs. 反向链0.5 reads），且阶段间无显著差异。三倍体/四倍体染色体因基因拷贝数增加呈现更高转录信号，但校正后单等位基因覆盖度趋于一致。62个转录起始区（dSSR）和48个终止区（cSSR）的分析揭示了保守的起始/终止模式，其中cSSR的转录渗漏现象提示Base J修饰可能参与终止调控。

IMPORTANCE
该研究颠覆性地证实环境压力（温度/pH变化）和宿主转换均不改变利什曼原虫的转录速率，其阶段特异性基因表达完全依赖mRNA稳定性等转录后机制。这一发现为开发靶向表观遗传修饰或RNA代谢的药物提供了理论依据。

INTRODUCTION
利什曼病作为被忽视的热带病，其病原体利什曼原虫通过白蛉传播，在宿主体内经历从前鞭毛体（25°C，pH 7.4）向无鞭毛体（37°C，pH 5.5）的形态转换。早期核运行实验已发现PTU的存在，但全基因组转录动态尚未解析。研究团队选择可体外诱导阶段转换的杜氏利什曼原虫株，结合PRO-seq技术（通过生物素化CTP标记新生RNA），克服了传统RNA-seq仅捕获成熟mRNA的局限。

MATERIALS AND METHODS
实验设计包含三组：对数生长期前鞭毛体、体外诱导无鞭毛体（7天分化）和radicicol处理前鞭毛体（72小时）。核运行反应使用1.5–2×10⁹
细胞，经链霉亲和素磁珠富集新生RNA后建库测序。生物信息分析基于TriTrypDB的BPK282A1基因组，排除RNA Pol I/III转录区后，通过BedTools计算PTU覆盖度。全基因组测序（MiSeq平台）用于校正染色体非整倍性对转录信号的影响。

RESULTS AND DISCUSSION

1. 染色体尺度转录均一性：36条染色体均被PRO-seqreads覆盖，三倍体染色体（8/12/23/26）和四倍体染色体（31）因拷贝数效应显示更高信号，但单等位基因标准化后差异消失（P>0.05）。
2. PTU功能特异性：端粒区短PTU（如染色体27的60S核糖体蛋白P0基因）呈现异常高转录，可能与邻近rRNA位点的Pol I通读有关。
3. 表观遗传标记与转录调控：dSSR处乙酰化组蛋白H3和变体H2A.Z/H2B.V的富集与转录起始相关，但ATAC-seq鉴定的染色质致密化（无鞭毛体）未影响起始模式。cSSR的渗漏转录（如染色体34的amastin基因下游）提示Base J缺失可能导致终止缺陷。

结论
该研究确立了利什曼原虫转录机器的"双组成型"特性：空间上全基因组均匀转录，时间上阶段转换不改变RNA合成速率。这种极端简化的调控模式与其快速适应宿主环境的需求高度契合，为研究真核生物转录进化提供了独特模型。未来整合组蛋白修饰（如H3V/H4V）和Base J图谱将进一步完善其调控网络解析。