基于RPA/CRISPR-Cas12f1_ge4.1双模式系统的结核分枝杆菌快速灵敏检测技术研究

本研究创新性开发了RPA/CRISPR-Cas12f1_ge4.1双模式检测系统，结合重组酶聚合酶扩增（RPA）与工程化Cas12f1_ge4.1的侧向切割活性，实现结核分枝杆菌（MTB）DNA的荧光（10 copies/μL）和侧流层析（100 copies/μL）双模式检测，临床验证显示94.52%灵敏度和100%特异性，为资源受限地区提供了高效诊断方案。

　　

发展RPA/CRISPR-Cas12f1_ge4.1双模式检测系统
针对结核病诊断的灵敏度与可及性挑战，研究团队构建了创新性双模式检测平台。该系统通过重组酶聚合酶扩增（RPA）在42°C下20分钟内完成MTB特异性基因IS6110/IS1081的等温扩增，结合工程化Cas12f1_ge4.1的侧向切割活性，触发荧光探针（FAM-BHQ1）或双标记侧流探针（FAM-Biotin）的信号释放。

优化荧光检测系统
通过系统筛选发现IS6110 sgRNA5在150 nM浓度下表现最优，配合100 nM Cas12f1_ge4.1蛋白和12-nt荧光探针，在46°C、10 mM Mg²⁺
条件下实现10 copies/μL的检测限。温度优化实验显示46°C时切割效率峰值，较野生型Cas12f1灵敏度提升100倍。

开发侧流层析检测模块
创新设计的侧流层析试纸条采用抗FAM金标抗体-链霉亲和素捕获体系，优化200 nM F-B探针浓度和20分钟反应时间后，可实现肉眼判读的100 copies/μL检测限。阴性样本仅显示质控线（C线），阳性样本则出现检测线（T线），T/C比值定量分析验证了结果的可靠性。

卓越的分析性能
灵敏度测试显示荧光模式对H37Rv菌株DNA的检测限达10 copies/μL，较侧流模式（100 copies/μL）更灵敏。特异性实验中，10种非结核分枝杆菌（NTM）和呼吸道病原体均未产生交叉反应，证实了IS6110靶向设计的特异性。

临床验证结果
在113例临床痰样本（73例MTB阳性）测试中，荧光模式灵敏度达94.52%（69/73），侧流模式为90.41%（66/73），两种模式特异性均为100%（40/40）。与商品化qPCR试剂盒对比，Kappa值分别为0.924和0.878，显示高度一致性。

技术优势与转化前景
该系统的双模式设计突破了传统CRISPR检测依赖复杂仪器的限制：荧光模式适用于实验室精准定量，侧流模式适合基层医疗点使用。1小时内完成检测的特性显著优于培养法（2-8周）和Xpert MTB/RIF（2小时），且成本降低约60%。未来通过微流控芯片整合，有望实现核酸提取-扩增-检测的全流程自动化。

现存挑战与改进方向
当前两步骤操作存在气溶胶污染风险，后续研究将探索单管反应体系。针对肺外结核诊断，需验证其在胸水、脑脊液等样本中的性能。通过定向进化改造Cas12f1_ge4.1的催化活性，或可进一步提升对cfDNA的检测灵敏度。

这项技术为结核病诊断提供了兼具实验室级精度与现场检测便捷性的解决方案，其模块化设计更可拓展至其他病原体检测领域，体现了CRISPR诊断技术在转化医学中的巨大潜力。