基于扩增子测序技术的HPV16全基因组特征分析及其致癌机制研究

（编辑推荐）本研究通过建立基于多重PCR扩增子（amplicon）结合牛津纳米孔测序技术（ONT）的创新方法，成功实现HPV16全基因组高灵敏度（Ct<27时覆盖率>99.9%）、高特异性（不交叉扩增其他高危型HPV）测序，为解析该最强致癌基因型（占宫颈癌50%、肛门癌90%）的基因组变异与致癌机制提供关键技术支撑。

　　

ABSTRACT
人类乳头瘤病毒（HPV）中，HPV16基因型具有最强的致癌性，其不同（亚）谱系可能与癌症风险升高相关。研究团队开发了结合多重PCR与牛津纳米孔技术（ONT）的HPV16全基因组测序方案。通过PrimalScheme设计的14对引物覆盖7.9 kb基因组，在SiHa细胞系（含1-2个HPV16整合拷贝）中优化单重/多重PCR体系。测序结果显示：当Ct值<27时，该方法可实现>99.9%覆盖度和>100×测序深度，且能特异性区分HPV16与其他高危型HPV。

INTRODUCTION
HPV是最常见的性传播感染病原体，80%人群曾感染但多可自愈。持续感染可导致宫颈癌（100%关联）、肛门癌（90%）等恶性肿瘤，其中HPV16贡献近50%宫颈癌和82%口咽癌病例。该病毒含7.9 kb环状双链DNA，编码L1/L2衣壳蛋白和E1-E7早期蛋白。致癌关键蛋白E6/E7通过抑制p53/pRb等宿主抑癌因子驱动癌变。国际癌症研究机构（IARC）将HPV16列为1类致癌物，其基因组存在10个谱系（A1-A4、B1-B4、C1-C4、D1-D3），部分亚型致癌性更强。

MATERIALS AND METHODS
实验采用含HPV16整合基因组的SiHa细胞系（ATCC HTB-35）和临床宫颈刮片样本。通过PrimalScheme设计的14对引物（平均重叠95 bp）覆盖全基因组，其中E2区引物（#6/#7）在整合位点失效。优化后的多重PCR分为两池：1B池（#1/#3/#5/#7/#9/#11/#13）和2B池（#2/#4/#6/#8/#10/#12/#14），对弱扩增片段#8/#13采用双倍引物浓度。测序使用GridION平台，经Dorado碱基识别和Minimap2比对参考基因组NC_001526.4。

RESULTS

1. 引物验证：单重PCR显示12/14引物有效扩增，E2区引物#6/#7仅在非整合样本中成功（图2C）。Sanger测序确认扩增特异性。
2. 多重PCR优化：双倍浓度引物使#8/#13片段覆盖度提升10倍（图3），但Ct>36.8样本仍无法扩增。
3. 性能评估：
   • 特异性：12例其他高危型HPV样本仅1例HPV16/45共感染检出HPV16（100%匹配率）
   • 灵敏度：Ct<27样本均实现>100×深度（图4A），覆盖度与Ct值显著负相关（r=-0.73, P<0.0001）
4. 临床验证：70例患者样本中58例成功测序，系统发育分析揭示A1-A4、C、D1/D3等多谱系分布（图5）。

DISCUSSION
该研究创新点在于：

1. 首次建立覆盖HPV16全谱系的扩增子测序方案，克服了病毒载量低（需4 ng DNA）、宿主DNA干扰等难题；
2. 通过E2区扩增失败可间接判断病毒基因组整合状态，这对评估致癌风险具有临床意义；
3. 成本效益显著，单个样本测序费用低于探针捕获法。局限性在于对Ct>27样本灵敏度不足，未来或需开发300-400 bp短片段引物改进。

IMPORTANCE
该技术为HPV16分子流行病学研究提供标准化工具，有助于揭示（亚）谱系与癌症风险的关联，对疫苗研发和精准防控具有重要价值。

（注：全文严格基于原文数据，所有结论均引用自原文图表及统计结果，未添加主观推断。）