墨西哥特有响尾蛇Crotalus morulus毒液中新型磷脂酶A2 的发现及其与抗蛇毒血清交叉反应机制研究

本研究针对墨西哥特有响尾蛇Crotalus morulus毒液中crotoxin-like毒素的分布异质性，通过重组抗crotoxin抗体筛选、RP-HPLC分离及Edman测序等技术，首次鉴定出两种新型磷脂酶A2 （Cm-PLA2 -1和Cm-PLA2 -2）。其中Cm-PLA2 -1具有强神经毒性（LD50 16.6 μg/20g小鼠），而Cm-PLA2 -2无显著毒性。研究发现商业抗蛇毒血清虽不能抑制Cm-PLA2 -1活性，但能中和全毒液（ED50 <40 mg抗体/mg毒液），为crotoxin类毒素的种内变异及抗毒血清开发提供了关键依据。

　　

在墨西哥山区分布的Tamaulipan响尾蛇（Crotalus morulus）是当地蛇伤的重要致病原，但其毒液成分长期未被系统研究。更棘手的是，这类蛇毒中是否存在crotoxin-like毒素——一种由非酶亚基CA和磷脂酶A₂
（PLA₂
）亚基CB组成的异源二聚体神经毒素，直接关系到抗蛇毒血清的疗效。既往研究表明，crotoxin在近缘物种如Crotalus lepidus klauberi中毒液中含量高达66%，能导致受害者弛缓性瘫痪，但不同地理种群间存在显著差异。这种"同种不同毒"的现象使得传统抗蛇毒血清可能出现交叉中和失败，每年墨西哥约1200例响尾蛇咬伤患者的救治面临挑战。

为破解这一难题，来自中国科学院生物技术研究所的研究团队对6条C. morulus个体毒液展开系统分析。通过重组表达crotoxin B亚基（rCrotxB）及AB复合体（rCrotxAB）制备特异性抗体，结合高效液相色谱（RP-HPLC）和质谱技术，在编号1032的个体毒液中发现了两种全新PLA₂
。令人惊讶的是，虽然该个体毒液致死剂量（LD₅₀
<40 μg/20g小鼠）显著高于其他个体，但其主要毒性成分Cm-PLA₂
-1与南美响尾蛇C. durissus terrificus的crotoxin B亚基有92%相似度，却对商业抗血清产生耐药性。与之形成鲜明对比的是无毒性Cm-PLA₂
-2，其30 μg剂量静脉注射未引起小鼠任何症状。

研究采用的关键技术包括：1）利用重组crotoxin亚基免疫制备兔源多克隆抗体；2）对6条野生捕获蛇的毒液进行SDS-PAGE和RP-HPLC组分分析；3）通过Edman降解和胰蛋白酶酶解测定PLA₂
一级结构；4）小鼠模型评估LD₅₀
和抗血清ED₅₀
。

【动物实验】
从新莱昂州多个地区捕获的6条C. morulus中，仅1032号个体毒液含crotoxin-like成分。其15 kDa主带经鉴定为PLA₂
家族蛋白，与C型凝集素共同构成毒液主要组分。

【电泳与色谱分析】
RP-HPLC分离出两个PLA₂
活性峰，经测序确认分别为含122个氨基酸的Cm-PLA₂
-1（14,492 Da）和Cm-PLA₂
-2（14,504 Da），二者均含7对保守二硫键。

【讨论】
该研究首次揭示C. morulus种群中存在crotoxin-like毒素的个体差异现象。Cm-PLA₂
-1虽与经典crotoxin B高度同源，但其酶活性不受抗血清抑制的特性，提示PLA₂
活性中心可能存在关键氨基酸变异。更值得注意的是，抗血清对全毒液的中和能力（ED₅₀
<40 mg/mg）表明毒液中可能存在未被识别的中和靶点。

【结论】
这项发表于《Acta Tropica》的研究为理解响尾蛇毒液种内变异提供了范式：1）同种蛇类个体间可存在crotoxin含量差异；2）PLA₂
结构微变异可能导致抗血清失效；3）抗毒血清生产需筛选含crotoxin的免疫原。这些发现不仅解释了临床抗血清疗效差异的分子基础，更为精准化抗毒血清开发指明了方向。