综述：自由扩散单分子FRET实验的定量分析方法

这篇综述系统评述了自由扩散单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术的最新定量分析方法进展，重点介绍了基于FRET效率的传统分析法和无需分箱的最大似然估计光子逐光子（photon-by-photon）技术，特别强调了解决分子亮度与扩散性差异所致偏差的新型算法，为蛋白质折叠、DNA动态及神经退行性蛋白寡聚化研究提供了有力工具。

　　

自由扩散单分子FRET技术的定量分析前沿

引言
单分子荧光共振能量转移（smFRET）已成为解析生物分子结构与动态过程的革命性工具。通过监测供体（donor）与受体（acceptor）染料间的非辐射能量转移，该技术可捕捉从纳秒至秒级时间尺度的构象变化。自由扩散模式下，分子在共聚焦体积内短暂停留（约毫秒级）并发射光子爆发（burst），但表面非固定化带来的短观测时间窗口催生了三维激光追踪、抗布朗电动力（ABEL）陷阱等延长停留时间的创新方法。

FRET效率基础分析法
传统方法通过计算爆发区间内受体与总荧光强度的比值（E_FRET
）获取分子距离信息，结合荧光相关光谱（FCS）可提升动态解析精度。此类模型无关（model-free）方法虽计算高效，但依赖分箱平均会损失时间分辨率，尤其在处理多态系统时可能掩盖瞬态中间态。

光子逐光子分析法
基于最大似然估计（MLE）的逐光子技术通过建模光子发射率时变特性，直接利用光子到达时间与颜色序列构建似然函数。例如，隐马尔可夫模型（HMM）能解析微秒级动态，而贝叶斯推断可量化参数不确定性。此类方法虽计算密集，但对异质性样本（如部分折叠蛋白）的解析能力显著优于传统分箱法。

整合平移扩散的进阶模型
当分子状态间存在亮度或扩散系数差异时（如折叠态因荧光淬灭变暗），常规爆发选择会产生系统性偏差。新开发的扩散-动力学耦合模型通过联合拟合扩散轨迹与光子序列，校正了此类偏差。以蛋白质G为例，其折叠态亮度降低60%的现象被精确量化，揭示了传统方法低估折叠态占比的问题。

应用与展望
这些方法已成功应用于：

1. 蛋白质折叠：解析了α-突触核蛋白（α-synuclein）病理性聚集早期的瞬态构象；
2. 核酸力学：捕捉到DNA发夹结构的亚毫秒级展开-重折叠动力学；
3. 神经退行机制：量化了tau蛋白寡聚体尺寸分布与毒性关联性。

未来方向包括开发实时分析算法与深度学习辅助的扩散校正，进一步拓展自由扩散smFRET在活细胞环境中的应用边界。

结论
自由扩散smFRET凭借无表面干扰的优势，结合日臻完善的定量分析方法，正推动单分子生物物理进入多维动态解析的新纪元。明确校正亮度-扩散效应将成为下一代算法的核心挑战，尤其在研究高度动态的致病蛋白聚集途径时。