多重直接RNA padlock探针结合原位测序技术(mudRapp-seq)实现甲型流感病毒转录与复制的单细胞可视化研究

本研究针对甲型流感病毒(IAV)转录与复制转换机制不明的关键问题，开发了多重直接RNA padlock探针结合原位测序技术(mudRapp-seq)，实现了16种IAV RNA分子在单细胞水平的同步可视化。研究发现直接RNA探针检测效率较传统cDNA探针提升3倍，通过5-6个探针/靶标可克服RNA结构干扰；时间进程分析揭示了M mRNA表达与病毒复制转换的显著相关性，为阐明RNA病毒复制机制提供了新工具。该技术发表于《Nucleic Acids Research》，为病毒学研究开辟了单细胞分辨率的新维度。

　　

流感病毒每年造成全球数百万人感染，其核心奥秘在于八段式负链RNA基因组如何精准调控转录与复制过程。传统研究面临两大瓶颈：一是病毒RNA分子与核糖核蛋白(vRNP)紧密结合导致检测困难；二是群体水平分析掩盖了单细胞异质性。这种时空动态的缺失使得学界对"病毒如何决定从mRNA转录转向vRNA复制"这一根本问题长期困惑。

德国Helmholtz感染研究中心的Shazeb Ahmad团队在《Nucleic Acids Research》发表突破性研究，开发出多重直接RNA padlock探针原位测序技术(mudRapp-seq)。该技术通过三大创新：1）采用PBCV-1 DNA连接酶实现RNA直接连接，效率较传统cDNA探针提升3倍；2）每个靶标设计5-6个padlock探针(PLP)，克服RNA二级结构干扰；3）引入双核苷酸条形码结合四色测序化学，实现16种IAV RNA（8vRNA+8mRNA）同步检测。纳米孔DMS-MaP结构探测揭示PLP效率与靶位点可及性显著相关（Pearson's r=0.46）。

关键技术包括：1）MDCK细胞感染模型（PR8株，MOI 0.3-1）；2）直接RNA padlock探针设计（35-40nt杂交臂）；3）splintR连接酶介导的环化反应；4）滚环扩增(RCA)与原位测序（Illumina四色化学）；5）单细胞分割算法（Cellpose 2.2.3）；6）纳米孔DMS-MaP RNA结构分析。

【Direct RNA padlock probing enables highly sensitive and strain-specific detection of IAV genomes】实验显示，单个PLP检测vRNA时，直接RNA法平均每细胞检出50.2个RCP，显著高于cDNA法的6.0个。菌株特异性实验证实，针对PR8与StPt株设计的PLP能精准区分90%相似度的病毒株（P<0.0001）。

【Multiple-direct RNA padlock probing improves the detection efficiency】DMS结构探测揭示NA_PLP9效率低下源于连接位点高反应性（A₁₂₉₁
-A₁₂₉₂
），而HA_PLP6/8虽靶位点结构复杂仍高效结合，说明RNA结构是重要但非唯一影响因素。五重PLP组合使检测效率达到饱和。

【mudRapp-seq workflow】双核苷酸条形码设计（首轮区分vRNA/mRNA，次轮识别片段）实现16重检测，四色测序各通道交叉率<3%，六轮测序正确率>97%。

【Temporal dynamics】时间进程显示：1）mRNA在1hpi即出现（NS最早），3-4h达稳态；2）vRNA呈双相增长（1h核内，7h胞质）；3）M mRNA与vRNA积累显著相关（r=0.96）。单细胞分析揭示：1）缺失PA/PB1/NP vRNA的细胞vRNA总量锐减（P<0.0001）；2）M mRNA高表达细胞vRNA增加3.8倍；3）RNP+M1预表达使vRNA/mRNA提升2.3倍，而M2则抑制40%。

该研究创立了病毒RNA研究的单细胞时空图谱新技术，首次揭示M蛋白（特别是M1）可能是转录-复制转换的关键调控因子。技术优势在于：1）克服vRNP复合物检测障碍；2）实现相似毒株共感染区分；3）揭示NS早发-M晚现的时空调控规律。未来可拓展至新冠病毒等RNA病毒研究，并为抗病毒药物靶点筛选提供新维度。