端粒酶RNA组分TLC1的3'端加工机制及其质量控制：CPF-CF介导的成熟过程与Nrd1-Nab3监控新机制

本研究揭示了酵母端粒酶RNA组分TLC1的功能成熟依赖于CPF-CF复合物介导的3'端加工及poly(A)尾形成，而非传统认为的Nrd1-Nab3-Sen1(NNS)终止途径。通过系统性突变分析，研究人员发现TLC1含有多重poly(A)信号(PAS)作为备份机制，其poly(A)尾通过反向折叠形成茎环结构，促进Sm环结合及核质穿梭。此外，首次提出Nrd1-Nab3作为核内监控系统清除过长转录本的双层质量控制模型，为理解非编码RNA成熟与端粒维持提供了新范式。

　　

端粒作为染色体末端的保护帽，其长度维持依赖于端粒酶的活性。在酿酒酵母中，端粒酶由逆转录酶Est2和长链非编码RNA TLC1等组分构成。尽管TLC1作为端粒合成的模板至关重要，但其转录终止机制长期存在争议：早期研究认为其通过Nrd1-Nab3-Sen1(NNS)途径终止，而近期证据显示可能存在CPF-CF依赖的poly(A)+前体。这种认知矛盾背后，隐藏着非编码RNA成熟路径的核心谜题——为何部分TLC1分子携带poly(A)尾？其核质穿梭如何与加工机制偶联？

德国哥廷根大学Heike Krebber团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究，通过整合遗传学、生化与单分子成像技术，系统解析了TLC1从转录终止到功能成熟的分子路径。研究发现TLC1的3'端加工严格依赖CPF-CF复合物对多重PAS位点的识别，产生的poly(A)尾通过反向折叠形成特定二级结构，这对Sm环结合和后续核重导入至关重要。更突破性的是，揭示了Nrd1-Nab3作为核内"分子守卫"监控过长转录本的新机制，建立了从转录终止到亚细胞定位的双层质量控制框架。

关键技术包括：酵母遗传学构建系列PAS和NNS位点突变株；RNA免疫共沉淀(RIP)分析Nrd1/Smb1结合；3'端PCR追踪不同长度转录本；单分子增强荧光原位杂交(smeFISH)定量核质分布；Southern blot监测端粒长度动态；RNA结构预测结合体内功能验证。

转录终止机制的重构
通过内源性突变Nrd1-Nab3结合位点(N1*)，研究发现尽管Nrd1结合降低至3.7%，端粒长度却未缩短。3'端PCR结合外源poly(A)聚合酶处理显示，野生型中仅检测到CPF-CF加工的poly(A)+转录本（180-250bp），而rrp6Δ突变体中也未发现NNS终止产物。这直接否定了NNS主导终止的旧模型。

PAS位点的层级备份系统
逐步突变7个PAS位点揭示：P1是主要加工位点，其失效后依次激活上游P0/P-1或下游P2-P5位点。当所有PAS突变时，仍能检测到URA3序列内的异常终止(RT3)。这种"故障保护"机制解释了为何即使强突变体TLC1^T
:P(-101)AT2345*:URA3仍能维持部分端粒功能。

poly(A)尾的结构生物学意义
RNAfold预测显示，野生型poly(A)尾反向折叠至T8重复区形成单一茎结构，而过长转录本(RT2)丧失此特征。实验证实删除T8/T6导致：①胞质滞留（smeFISH显示核定位降至29.4%）；②端粒缩短（Southern blot）；③Smb1-RIP中结合缺失。这阐明poly(A)尾通过构象调控决定RNP组装命运。

Nrd1-Nab3的监控新角色
在PAS突变背景下，Nrd1过表达选择性清除读通转录本（3'端PCR显示RT1/RT2减少），而N1突变导致读通产物积累。这种"竞争性结合"模型提出：CPF-CF成功组装会置换Nrd1-Nab3，反之则触发核外泌体降解。smeFISH证实N1P(-101)AT2345*双突变体出现核泄漏现象，揭示其作为第二道质量控制的必要性。

该研究颠覆了非编码RNA必然依赖NNS终止的传统认知，确立CPF-CF介导的3'端加工是TLC1功能成熟的核心驱动力。poly(A)尾构象调控机制的发现，为理解RNA结构-功能关系提供了新视角。更重要的是，提出的"核质双检"模型（核内Nrd1-Nab3监控与胞质Sm环筛选）拓展了RNA质量控制理论框架，对端粒相关疾病治疗策略开发具有启示意义。这种将转录终止机制与亚细胞定位偶联的研究范式，为其他RNP生物发生研究树立了典范。