基于β-葡萄糖苷酶基因gluF的多重PCR技术：实现小肠结肠炎耶尔森菌1A型菌株的高效检测

本研究针对食品中小肠结肠炎耶尔森菌(YE)检测的难题，特别是1A型(BT 1A)菌株缺乏特异性分子标记的问题，通过全基因组分析鉴定出β-葡萄糖苷酶基因gluF作为BT 1A的特异性靶点。研究人员开发了包含ail、ystA、ystB和gluF的多重PCR体系，实现了对全部YE生物型的同步检测，灵敏度达10 CFU/25g食品样本。该成果为食源性耶尔森菌病的防控提供了重要技术支撑，论文发表于《Journal of Applied Microbiology》。

　　

在食品安全领域，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica, YE)始终是令人头疼的"隐形杀手"。这种通过未煮熟猪肉传播的病原体，在欧洲2022年细菌性疾病发病率中高居第三。更棘手的是，YE家族中存在六个生物型，其中1A型(BT 1A)长期被视作"无害分子"，但近年却在英国、芬兰特别是新西兰的临床病例中频频现身——新西兰2018-2022年间12%-18%的耶尔森菌病竟由其引起，甚至引发过养老院奶昔污染导致的群体感染事件。传统检测方法面临双重困境：一方面BT 1A缺乏经典毒力基因ail和ystA，另一方面现有分子标记如foxA存在多态性缺陷，导致这个"伪装者"常常逃脱监测网络。

德国联邦风险评估研究所与新西兰环境科学研究所的科研团队联手破解这一难题。他们注意到一个关键生化特征：BT 1A能水解七叶苷(ESC)，这与其β-葡萄糖苷酶(βGLU)活性相关。研究组选取典型BT 1A菌株19-YE00019进行全基因组测序，通过生物信息学筛选出7个βGLU相关基因，最终锁定gluF作为特异性靶标——该基因在248株德国来源BT 1A中检出率超99%，且与致病型菌株完全区分。研究人员巧妙设计592bp扩增片段的引物，将其与ail、ystA、ystB组合成四重PCR体系，在人工污染实验中成功从10 CFU/25g的碎猪肉样本中同时检出BT 1A和4/O:3型菌株。

关键技术方法包括：Illumina和纳米孔双平台全基因组测序获取BT 1A参考基因组(CP155581)；生物信息学分析比较7个βGLU基因的分布特征；设计gluF特异性引物并验证其灵敏度；建立包含四种毒力标记的多重PCR体系；采用ISO 10273:2017标准方法处理食品样本。

GluF仅存在于BT 1A
全基因组分析揭示gluF位于包含磷酸转移酶系统的保守操纵子中，与相近耶尔森菌种属序列相似性仅81-85%。248株测序菌株中，gluF呈现>98%的高保守性，显著优于ystB(>96%)。值得注意的是，两株ESC阴性菌株恰好缺失gluF操纵子，从基因层面证实了其功能关联。

gluF PCR具有高度特异性和灵敏度
设计的引物在德国和新西兰分离株中均表现优异，单拷贝检测限实验显示可检出1 CFU/反应。引物区域仅存在两个单核苷酸多态性(SNP)，且不影响扩增效率。生物信息学预测显示引物对非YE菌种如棒状杆菌、军团菌等无交叉反应。

多重PCR验证
在包含不同生物型的43株验证菌株中，体系完美区分BT 1A(gluF+/ystB+)与致病型(ail+/ystA+)。特别的是，一株携带ail的BT 1A(23-YE00429)被准确识别，凸显了gluF相较于传统标记的优越性。食品模拟实验证实，该技术能克服食品基质的干扰，保持高检测灵敏度。

这项研究通过创新性地挖掘gluF的分子诊断价值，首次建立起覆盖全部YE生物型的检测方案。其重要意义体现在三方面：首先，解决了BT 1A缺乏特异性标记的难题，为追溯临床不明原因感染提供工具；其次，四重PCR体系实现了致病型与非致病型的同步鉴别，有助于食品安全风险评估；最后，建立的食品检测方法灵敏度满足国际标准要求，可直接应用于监测系统。正如作者强调，该技术已准备投入德国常规食品检测，将为预防耶尔森菌病提供强有力的技术屏障。研究也留下有趣悬念：那两株gluF阴性的BT 1A是否代表新的进化分支？这为后续研究指明了方向。