基于冻干微球与侧流层析技术的猴痘病毒即时检测新装置开发

为应对猴痘病毒(MPXV)在资源匮乏地区的快速检测需求，研究人员开发了一种结合环介导等温扩增(LAMP)、冻干微球和侧流层析技术的即时诊断(POC)装置。该研究优化了F3L-1引物组(灵敏度达70拷贝/反应)，验证了临床样本检测效能(1-5×LoD)，并通过加速老化实验证明试剂稳定性(37°C保存63天等效室温166天)，为缺乏PCR设备的地区提供了高灵敏度、可视化的解决方案。

　　

猴痘病毒(MPXV)引发的猴痘(mpox)疫情已成为全球公共卫生挑战。尽管实时荧光定量PCR(qPCR)是临床诊断的金标准，但其依赖复杂设备、专业人员和冷链运输的特点，严重限制了在资源匮乏地区的应用。尤其在西非和中非等MPXV流行区，缺乏快速、可靠的现场检测手段导致疫情控制滞后。更棘手的是，MPXV可通过动物宿主、呼吸道飞沫甚至性接触传播，而现有抗体检测方法的灵敏度与特异性不足。这些现实困境催生了对无需复杂设备、可常温保存且能肉眼判读结果的检测技术的迫切需求。

针对这一技术瓶颈，研究人员开发了一种创新性的即时检测(POC)装置。该装置的核心技术突破体现在两方面：一是采用冻干工艺将环介导等温扩增(LAMP)试剂制成室温稳定的微球，解决了传统核酸扩增试剂的冷链依赖问题；二是通过侧流层析试纸条实现扩增产物的可视化检测，避免了对昂贵荧光检测设备的依赖。研究选用2022年全球流行的MPXV分支IIb作为靶标，通过温度梯度实验确定65°C为LAMP反应的最适温度。在引物筛选环节，比较了靶向F3L和A27L基因的4组引物，发现F3L-1引物组性能最优。为验证实际应用价值，研究还设计了包含人类核糖核酸酶P蛋白亚基POP7的内控系统，确保检测过程的质量控制。

关键技术方法包括：1) 设计靶向MPXV F3L和A27L基因的LAMP引物组；2) 开发兼容冻干微球的病毒裂解缓冲液(含2.5 M盐酸胍和0.5% Triton X-100)；3) 构建三线式侧流层析试纸条(检测线1捕获DIG标记的MPXV扩增产物，检测线2捕获FAM标记的POP7内参，质控线结合链霉亲和素)；4) 采用ASTM F1980标准进行37°C加速老化实验；5) 使用临床皮肤拭子样本验证检测效能。

3.1 温度与引物优化
通过时间阈值(Tp)分析确定65°C为LAMP反应最佳温度，较60-70°C范围显著缩短扩增时间。在200拷贝MPXV DNA模板下，F3L-1引物组的扩增效率显著优于F3L-2和A27L引物组。引人注目的是，组合使用A27L+F3L-1引物并未进一步缩短Tp，提示引物数量并非反应速度的决定因素。

3.2 灵敏度分析
F3L-1单引物组的检测限(LoD)为70拷贝/反应(10/10重复阳性)，而A27L+F3L-1组合仅将LoD略微提升至60拷贝。值得注意的是，50拷贝浓度下所有引物组合均未检出，表明反应体系存在灵敏度阈值。

3.3 侧流层析检测
设计的试纸条成功实现双信号检测：灰色检测线1指示MPXV阳性，检测线2(FAM-POP7)验证样本质量。在70拷贝LoD浓度下，试纸条检测结果与实时荧光法完全一致，证实其可作为qPCR的可靠替代方案。

3.5 与qPCR性能对比
当检测70拷贝MPXV时，对应qPCR循环阈值(Ct)为32.7，处于临床认可的阳性范围(Ct<35)。虽然qPCR理论上可检测单拷贝核酸，但实际临床环境中LAMP的70拷贝灵敏度已能满足多数诊断需求。

3.6 临床验证
使用1-5倍LoD(70-350拷贝)的临床皮肤拭子样本测试，所有浓度均获阳性结果，且内控POP7信号稳定，证实该方法对复杂临床样本的适应性。

3.7 试剂稳定性
加速老化实验显示，冻干微球在37°C保存63天(相当于室温23°C约166天)后仍保持检测活性，仅MPXV检测线显色略有减弱，这一特性使其特别适合热带地区使用。

这项研究通过多重技术创新，成功将实验室级的MPXV检测转化为适用于资源受限场景的POC解决方案。其科学价值体现在三方面：首先，冻干微球技术突破了传统LAMP试剂的温度敏感性限制；其次，侧流层析与LAMP的结合实现了核酸扩增结果的设备无关判读；最后，内控系统的引入大幅提升了检测可靠性。相较于此前报道的RPA-CRISPR系统(如SCOPE平台)或单纯LAMP方法，该装置在操作简便性(无需DNA提取)、结果判读直观性和试剂稳定性方面具有明显优势。

研究的局限性在于目前仅验证了对MPXV分支IIb的检测效能，未来需扩展至分支I毒株的检测。此外，虽然60拷贝的LoD已接近qPCR的临床检测阈值，但通过优化酶组合或反应缓冲液成分，仍有进一步提升灵敏度的空间。从转化医学角度看，这项技术可快速适配其他病原体检测，为新发传染病的现场筛查提供技术范本。论文发表于《Journal of Clinical Virology Plus》，标志着该技术已通过同行评审的严格验证，为其后续临床应用奠定了坚实基础。