单细胞RNA测序中靶向参考构建(TORC)策略提升细胞类型鉴定准确性

本研究针对单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析中细胞类型鉴定这一关键问题，开发了靶向参考构建(TORC)新策略。研究人员通过两轮预测算法构建与目标数据集匹配的参考数据集，有效解决了参考与目标间数据分布和细胞类型组成的差异问题。实验证明该方法可显著提高多种算法(MLP/ACTINN/scNym等)的鉴定准确率，为大规模单细胞研究提供了重要技术支撑。

　　

在单细胞生物学时代，准确鉴定细胞类型是解析组织异质性的首要挑战。尽管监督学习方法因其准确性在scRNA-seq分析中日益普及，但现有研究大多聚焦算法开发，忽视了参考数据集质量这一根本问题。布朗大学等机构的研究团队在《Genome Biology》发表的研究揭示：当参考与目标样本存在细胞类型比例差异或批次效应时，即使最优算法也会出现显著性能下降。

这项研究创新性地提出靶向参考构建(TORC)策略，其核心是通过动态调整参考数据集来匹配目标特征。研究团队首先用多层感知器(MLP)等算法对目标细胞进行初步分类，基于预测置信度筛选细胞构建扩展参考池，最后按估计的目标细胞比例重采样构建优化参考集。关键技术包括：F-test特征选择、两轮预测框架、基于熵的置信度评估，以及跨数据集(PBMC来自COVID-19/狼疮患者等)的验证策略。

【算法概述】
TORC采用两阶段预测框架：首轮使用原始参考训练分类器预测目标细胞组成，通过计算预测概率矩阵的熵值筛选高置信度目标细胞；将这些细胞加入参考池后，按估计比例重采样构建新参考集；最终用优化参考集重新训练分类器。研究测试了MLP、ACTINN、scNym、scANVI和Seurat等多种算法组合。

【参考质量的双重影响】
通过分析21个目标数据集发现：参考质量取决于两个维度——细胞类型特异性表达谱相似度和细胞类型组成相似度。当细胞比例存在倒置时(如细胞毒性T细胞与初始T细胞比例反转)，传统方法准确率仅84%，而TORC调整参考比例后提升至90%。在跨研究数据(如COVID-19CN与UK数据集)中，参考扩展策略可缓解批次效应。

【多算法验证】
在PBMC数据集上，TORC使MLP平均准确率提升5-15%。其他算法也显著获益：ACTINN最大增益达18%，scNym提升12%，scANVI提高9%，Seurat改进7%。值得注意的是，使用MLP构建参考后，其他算法无需修改即可获得提升，显示TORC的算法无关性。

【技术优势分析】
相比平衡采样等传统方法，TORC具有独特优势：1) 计算效率高，MLP构建参考耗时仅为scANVI的1/3；2) 可扩展性强，支持整合多源参考数据；3) 兼容性强，与现有算法无缝衔接。在"FACS"金标准数据集上，TORC将最难区分的T细胞亚型错误率降低40%。

研究结论指出，TORC首次系统解决了scRNA-seq分析中参考数据集优化的关键问题。其创新性体现在：1) 提出参考质量应相对于目标评估的新范式；2) 开发可量化的参考构建框架；3) 证实细胞类型组成与表达谱同等重要。作者建议未来可扩展至scATAC-seq等单细胞多组学领域，并探索细胞类型特异性质量评分体系。这项工作为大规模单细胞图谱项目提供了重要的方法学基础，特别是在涉及多中心、跨种族样本整合时具有突出价值。