无DMSO冷冻保存技术突破：hiPSC来源心肌细胞低温特性解析与方案优化

针对传统冷冻保护剂DMSO对hiPSC-CMs（人诱导多能干细胞来源心肌细胞）的毒性问题，明尼苏达大学团队通过低温拉曼光谱和差分进化算法，开发出含天然渗透剂的DMSO-free冷冻方案，实现>90%复苏率并保持钙瞬变功能，为心脏疾病模型构建和细胞治疗提供关键技术支撑。

　　

心血管疾病作为全球主要死因，每年导致约900万例缺血性心脏病死亡。由于成体心肌细胞再生能力有限，hiPSC-CMs（human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes）成为疾病建模、药物筛选和再生治疗的研究热点。然而传统冷冻方案依赖具有细胞毒性的DMSO（二甲基亚砜），不仅导致复苏率仅50-80%，还会引发患者过敏反应和DNA甲基化异常。更棘手的是，现有研究对冷冻速率、成核温度等关键参数缺乏系统探索，严重制约hiPSC-CMs的临床应用。

针对这些挑战，明尼苏达大学Akshat S. Mallya团队在《Stem Cell Research》发表重要研究。通过Wnt通路抑制和乳酸纯化获得高纯度hiPSC-CMs后，团队创新性地结合差分进化（DE）算法优化天然渗透剂组合，采用低温拉曼光谱解析溶质分配规律，并系统评估不同冷冻参数对细胞存活的影响。研究最终建立的无DMSO方案不仅突破性实现92.06±2.50%复苏率，更首次揭示心肌细胞独特的渗透行为特征。

关键技术包括：1）DE算法驱动优化海藻糖-甘油-异亮氨酸组合；2）可控速率冷冻系统测试1-5°C/min冷却速率；3）低温拉曼光谱测定溶质分配比；4）钙瞬变分析评估功能完整性；5）免疫荧光验证表型维持。所有实验使用CCND2 hiPSC系（源自健康女性心脏成纤维细胞）第57-79代细胞。

【hiPSC-CMs的生物物理特性】
通过Boyle-van't Hoff曲线分析发现，hiPSC-CMs直径（14.86±0.05μm）显著大于hiPSCs（13.48±0.03μm），且具有高达0.4的渗透非活性体积分数。这种结构特征预示其对脱水损伤异常敏感，为后续冷冻方案设计提供关键参数。

【DMSO-free冷冻保护剂优化】
采用DE/1/rand/bin算法，经过6代迭代筛选出3种渗透剂最佳组合。最优配方（Solution A）复苏率达92.06±2.50%，显著优于DMSO对照组（69.4±6.4%）。三维恢复等值线图显示，甘油浓度与复苏率呈正相关，而海藻糖和异亮氨酸需特定配比才能形成"高效岛"，暗示天然低共熔系统（NADES）的形成可能增强保护效果。

【冷冻参数优化】
突破传统"两因素假说"，发现5°C/min快速冷却配合-8°C成核温度效果最佳。低温拉曼光谱显示该条件下溶质分配比（P=1.00±0.14）最接近1，表明细胞内外的DMSO浓度达到动态平衡。值得注意的是，3°C/min中等速率反而导致最差复苏率（P=0.82±0.13），揭示心肌细胞对脱水损伤的特殊敏感性。

【异常渗透行为】
解冻后hiPSC-CMs表现出独特体积响应：在等渗培养基中不出现预期膨胀，反而在30分钟内急剧收缩至渗透非活性体积（0.4V₀
）。这种反常现象与啮齿类心肌细胞研究一致，可能源于细胞骨架对渗透压变化的特殊响应机制。

【功能验证】
钙瞬变分析显示，Solution A处理的细胞保持正常F/F₀
（1.82±0.15）和上升/下降速度比（1.07±0.04），与新鲜细胞无统计学差异。免疫荧光证实解冻后细胞仍高表达F-actin和Nkx2.5，维持典型心肌表型。值得注意的是，高糖配方（Solution B）虽复苏率相当，但钙处理功能显著受损，提示渗透剂配比需精确调控。

这项研究首次系统解析hiPSC-CMs的低温生物学特性，建立的DMSO-free方案突破性地将复苏率提升至90%以上。更重要的意义在于：1）揭示心肌细胞独特的渗透响应规律，为其他终末分化细胞冷冻提供新思路；2）证实天然渗透剂组合可完全替代DMSO，避免其表观遗传毒性；3）确立5°C/min快速冷冻标准，颠覆传统"慢冻"教条。该技术将显著推动hiPSC-CMs在心脏毒性筛选、疾病模型构建和细胞治疗中的应用，特别是对需要反复冻存的药物开发场景具有变革性价值。未来研究可进一步探索冷冻敏感亚群特征，并开发针对异常渗透行为的专用复苏方案。