CRISPR基因与表观基因组双重编辑系统CRISPRgenee：提升功能缺失筛选效率与可靠性的创新技术

《Cell Reports Methods》：CRISPR GENome and epigenome engineering improves loss-of-function genetic-screening approaches

本文介绍了一种创新的CRISPR基因与表观基因组双重编辑系统CRISPRgenee，通过整合CRISPR敲除（CRISPRko）和CRISPR干扰（CRISPRi）技术，实现了同步基因敲除和表观沉默。该系统显著提高了功能缺失（LOF）筛选的效率与可重复性，解决了传统方法中残留蛋白表达和sgRNA设计局限等问题，为基因功能研究和疾病机制探索提供了更可靠的工具。

CRISPR基因与表观基因组双重编辑系统CRISPRgenee的创新突破

Motivation
CRISPR技术（包括CRISPRko和CRISPRi）能够特异性敲除基因并减少脱靶效应，但其应用仍存在局限性。例如，DNA修复或可变剪接可能导致残留活性蛋白表达，而表观遗传调控和sgRNA设计的困难也限制了CRISPRko或CRISPRi的潜力。为了解决这些问题，研究团队开发了CRISPRgenee系统，通过整合CRISPRko和CRISPRi技术，实现了更高效的基因功能缺失研究。

Highlights
CRISPRgenee系统具有以下亮点：

1. 同步实现基因敲除和表观沉默；
2. 显著提升功能缺失效果；
3. 改善sgRNA异质性，提高筛选质量；
4. 适用于高分辨率小规模文库筛选。

Summary
CRISPR-Cas9技术通过大规模功能缺失（LOF）筛选实现了基因型与表型的关联研究，但其效率受限。CRISPRgenee通过使用两种特异性sgRNA在同一细胞中同时敲除和抑制目标基因，提高了LOF效率和可重复性。该系统在抑制细胞增殖调控因子和上皮-间质转化（EMT）调节因子方面表现出色，且比传统CRISPRko或CRISPRi筛选更高效。

Truncated sgRNAs prevent CRISPR nuclease activity while simultaneously silencing gene expression
研究团队将功能性Cas9与ZIM3-KRAB结构域融合，构建了ZIM3-Cas9系统。通过使用截短的15-nt sgRNA，该系统能够在启动子区域招募dCas9-ZIM3并实现高效的基因沉默，同时避免DNA切割活性。实验证明，15-nt sgRNA与20-nt sgRNA在基因沉默效果上无显著差异，但前者能更快实现沉默。

CRISPRgenee significantly accelerates and increases CRISPR-mediated gene depletion
CRISPRgenee通过结合CRISPRko和CRISPRi sgRNA，显著加速了基因沉默过程，并减少了sgRNA性能的变异性。实验显示，CRISPRgenee在7天内即可实现显著的基因抑制效果，且效果随时间增强。

Truncated and normal-length sgRNAs exhibit similar off-target effects
通过RNA测序分析，研究发现15-nt和20-nt sgRNA的脱靶效应相似，且截短sgRNA并未增加非特异性结合风险。这一发现为CRISPRgenee的安全性提供了支持。

Assessment of phenotypic consequences following CRISPRgenee-mediated BUB1 depletion
以BUB1基因为例，CRISPRgenee显著加速了BUB1的缺失表型，且效果优于传统CRISPRko或CRISPRi方法。实验还证实，CRISPRgenee能够有效抑制细胞增殖，并诱导细胞周期阻滞。

CRISPRgenee extends to non-tumorigenic and stem cell contexts
CRISPRgenee在非肿瘤性细胞（如MCF10A）和干细胞（如iPSC）中同样表现出色。例如，在MCF10A细胞中，CRISPRgenee成功抑制了TGF-β诱导的EMT过程，而在iPSC中则未影响神经元分化。

CRISPRgenee improves LOF screen performance
通过大规模筛选实验，CRISPRgenee显示出更高的sgRNA一致性和更低的假阳性率。与传统的双sgRNA策略相比，CRISPRgenee能够更可靠地识别功能缺失表型。

CRISPRgenee generates improved dropout effects through a combinatorial effect of CRISPRi and CRISPRko
CRISPRgenee通过结合CRISPRi和CRISPRko的优势，显著提升了基因缺失效果。实验证明，针对同一基因的不同转录起始位点（TSS），CRISPRgenee能够实现更高效的沉默。

Hit validation illustrates specific CRISPRgenee benefits
通过验证筛选结果，研究发现CRISPRgenee能够识别传统方法难以检测的基因依赖性，例如KDM1A和GFI1B在白血病中的关键作用。

Discussion
CRISPRgenee作为一种创新的双重sgRNA系统，通过整合基因编辑和表观沉默，显著提升了功能缺失筛选的效率和可靠性。其应用前景广阔，包括复杂分子表型研究和细胞数量受限的实验设计。未来研究将进一步优化该系统，以拓展其在生物医学领域的应用。