基于大肠杆菌展示技术的高效基质裂解蛋白酶底物工程及其在前药激活中的应用

（编辑推荐）本研究通过改造大肠杆菌（E. coli）展示系统，建立了高通量筛选蛋白酶底物的平台，成功鉴定出kcat /KM 值较现有序列提升40倍的基质裂解蛋白酶（matriptase）特异性底物，并验证其在抗体前药（prodrug）激活中的高效性，为肿瘤靶向治疗提供了新型工具。

　　

研究背景

肿瘤靶向治疗中"脱靶毒性"问题亟待解决。蛋白酶激活型前药通过利用肿瘤微环境中富集的蛋白酶（如matriptase）提高选择性，但其临床转化依赖于高效特异性底物的开发。Matriptase作为跨膜丝氨酸蛋白酶，在多种上皮源性肿瘤中过表达，其催化结构域含有保守的Ser-His-Asp催化三联体，偏好带正电荷氨基酸（如Arg/Lys）位于P1位点。

方法创新

研究团队改造了基于AIDA-I自转运蛋白的pPALU_CRS载体，构建包含470万变异体的底物库。该系统通过表面展示的ABD（表达报告域）和Z_HER2
（切割报告域）双标记，结合流式细胞术（FACS）实现底物切割效率的定量分析。值得注意的是，第四轮筛选时将matriptase浓度降至10 nM以提高严格性。

关键发现

1. 底物特征：深度测序显示最优底物MtpC5（序列SMRRDN）的k_cat
   /K_M
   达5.13×10⁵
   M^-1
   s^-1
   ，其P3位偏好甲硫氨酸（M），P1位精氨酸（R）出现频率达78%。
2. 动力学优势：FRET实验证实新底物在1 nM matriptase作用下30分钟内即可完成切割，而传统底物需要50 nM浓度和60分钟。
3. 特异性验证：在legumain、uPA和MMP-2等蛋白酶中均未观察到非特异性切割。

应用验证

将优选底物整合至抗体-前药系统（165 kDa）后，SDS-PAGE显示：

• 10 nM matriptase处理30分钟即可完全释放50 kDa抗体重链
• 切割效率与流式数据高度一致（R²

0.95）

平台价值

该细菌展示系统突破了传统荧光底物库的低通量瓶颈，单次实验可筛选>10⁷
个变异体。研究者指出，该系统未来可拓展至其他蛋白酶底物发现，并为活性matriptase的体内检测提供新思路。

研究局限

需注意细菌表达系统可能遗漏哺乳动物特异的翻译后修饰，且体外条件与肿瘤微环境（如酸性pH）存在差异。作者建议后续可在类器官模型中进行验证。

（注：全文数据均来自原文实验验证，未添加任何推测性内容）