米曲霉工程化改造提升麦角硫因生物合成效率及其抗氧化机制研究

直接打印回答内容： 本研究通过基因工程策略在米曲霉（Aspergillus oryzae）中鉴定并过表达内源基因AoEgt1/AoEgt2及外源真菌同源基因，结合葡萄糖和甲硫氨酸（Met）优化培养基，使麦角硫因（EGT）产量提升至20.03 mg/g干重（8倍于野生型）。首次揭示AoEgt1定位于液泡、AoEgt2定位于过氧化物酶体的亚细胞分布特征，为真菌EGT合成机制及工业化生产提供新思路。

　　

麦角硫因的生物合成与工程化改造

摘要
麦角硫因（Ergothioneine, EGT）是一种稀有的含硫氨基酸衍生物，具有卓越的抗氧化和抗炎特性，在食品、化妆品和医药领域应用广泛。研究团队以食用真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）为宿主，通过基因工程手段显著提升了EGT产量。实验鉴定出两个内源基因AoEgt1和AoEgt2，分别定位于液泡和过氧化物酶体，并证实其参与EGT生物合成。通过过表达不同来源的EGT合成基因，产量达到15.17 mg EGT/g干重；进一步优化培养基（葡萄糖为碳源，补充0.4%甲硫氨酸），产量提升至20.03 mg/g干重，较野生型提高8倍。

引言
EGT于1909年首次在麦角菌（Claviceps purpurea）中发现，人类需通过饮食获取。其通过特异性转运蛋白靶向递送至氧化损伤部位，减轻细胞氧化应激，被归类为“长寿维生素”。EGT在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）和代谢性疾病（糖尿病、心血管疾病）中展现出治疗潜力。2017年，EGT获美国GRAS（公认安全）认证，成为抗衰老化妆品和功能食品的热门成分。

微生物合成EGT存在两条途径：细菌途径依赖EgtABCDE基因簇，而真菌途径仅需Egt1和Egt2两个基因。米曲霉因其强大的生物合成能力和安全性成为理想宿主，但其野生型EGT产量极低。

材料与方法
通过BLAST比对鉴定出米曲霉内源基因AoEgt1（含5-组氨酸半胱氨酸硫合酶结构域）和AoEgt2（PLP依赖的半胱氨酸脱硫酶结构域）。利用农杆菌介导转化（ATMT）构建过表达菌株，采用GFP/Mcherry标记进行亚细胞定位分析。EGT产量通过HPLC检测，优化培养基成分包括碳源（葡萄糖、蔗糖等）和氨基酸前体（组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）。

结果

1. 基因鉴定与进化分析
   AoEgt1在曲霉属中序列一致性达69-99%，与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）NcEgt1一致性为49%；AoEgt2与黄曲霉（Aspergillus flavus）一致性高达99%。

2. 亚细胞定位
   AoEgt1-Mcherry与液泡标记蛋白AoVam3-GFP共定位，AoEgt2-Mcherry与过氧化物酶体标记GFP-PTS1共定位，而外源基因NcEgt1/CmEgt2均定位于细胞质。

3. 产量提升策略

• 过表达AoEgt1/AoEgt2使产量提升至10.01 mg/g干重（4倍）；
• 外源基因组合NcEgt1+CmEgt2效果最佳（15.17 mg/g干重）；
• 0.4%甲硫氨酸补充使产量达20.03 mg/g干重，过量（0.8%）抑制菌体生长。

讨论
米曲霉的液泡和过氧化物酶体定位暗示EGT合成与氧化应激防御相关。甲硫氨酸通过提供S-腺苷甲硫氨酸（SAM）增强甲基化反应，是产量限制因素。相比细菌途径，真菌双基因系统（绕过γ-谷氨酰半胱氨酸竞争）更高效，近期在里氏木霉（Trichoderma reesei）基因改造的大肠杆菌中产量达4.34 g/L。

展望
未来需解析EGT转运机制，并通过代谢网络模型优化关键酶表达。本研究为米曲霉作为EGT细胞工厂的工业化应用奠定基础，同时为功能性发酵食品开发提供新策略。