基于DNA转录因子结合阵列的哺乳动物细胞基因表达调控新策略

本研究针对哺乳动物细胞工程中基因调控工具依赖蛋白表达的局限性，开发了转录因子(TF)识别元件(RE)阵列技术。通过创新性构建方法CTRL成功组装含256个重复RE的质粒，证实其可有效调控合成基因回路并揭示内源TF相互作用机制，为无表达负担的细胞命运调控提供了新工具。

　　

在合成生物学领域，精确控制哺乳动物细胞基因表达始终面临关键挑战。传统方法依赖转录因子(TF)过表达，但存在基因沉默、致癌风险及细胞资源竞争等问题。更棘手的是，现有"诱饵"技术如自复制质粒和寡核苷酸存在免疫原性、稳定性差等缺陷，且无法利用真核TF的协同结合特性。这些局限性严重制约了细胞工程在再生医学和疾病治疗中的应用潜力。

针对这一技术瓶颈，帝国理工学院的研究团队在《TRENDS IN Biotechnology》发表创新成果。研究人员开发了基于DNA的转录因子结合阵列技术，通过工程化重复转录因子识别元件(RE)实现哺乳动物细胞基因表达的精准调控。这项研究首次将微生物系统中验证的RE阵列策略成功拓展至哺乳动物领域，并创建了名为CTRL的迭代组装方法，突破长重复序列构建的技术障碍。

关键技术方法包括：1) 开发CTRL克隆系统，通过交替使用BioBrick和Golden Gate组装实现RE阵列的指数级扩增；2) 建立基于TetR/dCas9的合成基因回路验证平台；3) 采用流式细胞术定量分析RE阵列对报告基因表达的调控效果；4) 利用氧化应激模型评估内源NRF2转录因子的 sequestration效应；5) 通过慢病毒载体将Prrx1/Tead1 RE阵列递送至小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)研究细胞重编程影响。

TF RE array plasmids can sequester synthetic TFs in mammalian cells
研究团队首先以TetR家族转录因子为模型，证实含7-320个TetO重复序列的质粒可剂量依赖性调控报告基因表达。在HEK-293T细胞中，320xTetO阵列使EGFP表达降低86%，而CHO-K1细胞中降低54%。通过设计包含pEF1a启动子和TetOscr序列的对照质粒，排除了非特异性效应。特别值得注意的是，RE阵列对正反馈回路的调控敏感性显著高于负反馈回路，仅需0.5倍摩尔比的TetOx7即可抑制67%表达，揭示了不同拓扑结构回路的调控差异。

Assembly of arrays of repetitive sequences by CTRL
为解决重复序列组装难题，研究人员开发了CTRL技术。该系统采用低拷贝数载体和中性间隔序列防止重组，通过红/白菌落筛选和限制性酶切验证，成功构建含256个重复RE的质粒。四轮组装效率分析显示，前三轮成功率>92%，第四轮降至40%。该方法兼容哺乳动物工具包(MTK)，可灵活转换为慢病毒载体。在Prrx1/Tead1 RE阵列转导实验中，虽然16-32个RE的阵列未影响MEF向运动神经元的转分化效率，但证实了该技术在体内应用的可行性。

ARE array plasmids sequester NRF2 in mammalian cells
针对内源转录因子的研究发现，含128个抗氧化反应元件(ARE)的阵列在0.5μM auranofin诱导下导致>80%细胞死亡，而对照TetOx320无此效应。通过NRF2报告系统证实，4倍过量的12xARE阵列可抑制40%的启动子活性。更有趣的是，ARE阵列通过解除NRF2对NF-κB的抑制，使NF-κB报告基因表达增强5倍，首次展示了RE阵列解析TF相互作用的潜力。

这项研究的意义在于：1) 创建了不依赖蛋白表达的基因调控新范式，缓解细胞资源竞争；2) 开发的CTRL技术突破重复序列组装限制；3) 为解析哺乳动物TF相互作用网络提供新工具；4) 展示了在细胞命运调控中的应用前景。正如作者强调，该技术尚处于TRL3-4阶段，需进一步评估长期稳定性。未来通过优化RE序列设计、研究协同结合效应，有望推动其在疾病模型和再生医学中的转化应用。