体内筛选揭示Notch激活的力依赖性蛋白水解开关多样性及其在细胞接触信号中的广泛作用

Baker等通过果蝇体内筛选，发现多种蛋白结构域可作为机械力依赖的蛋白水解开关（proteolytic switches）替代Notch负调控区（NRR），其激活依赖配体内吞（endocytosis）和ADAM10蛋白酶Kuzbanian（Kuz）活性。该研究拓展了力敏感蛋白水解开关的多样性，提示ADAM10介导的机械力依赖蛋白水解可能在多种细胞接触依赖性信号机制中广泛存在。

　　

体内筛选揭示多样结构域作为Notch力依赖性蛋白水解开关的机制

Editor’s summary
机械力可诱导跨膜蛋白被蛋白酶切割。Notch受体的激活依赖于其近膜结构域（NRR）在邻细胞配体内吞产生的拉力作用下发生切割。本研究通过构建嵌合Notch和Delta蛋白，在果蝇翅膀发育模型中筛选能替代NRR的功能性结构域，发现包括接触依赖性信号蛋白在内的多种结构域均可依赖配体内吞和Kuz蛋白酶活性激活Notch，表明力依赖性蛋白水解开关在生理条件下具有广泛存在性。

Abstract
Notch作为单次跨膜受体，需经历胞外和膜内连续切割释放胞内转录因子结构域。Delta/Serrate/LAG-2（DSL）家族配体通过跨细胞桥施加拉力激活Notch，该拉力由信号发送细胞内Epsin介导的配体内吞产生，并触发信号接收细胞中ADAM10蛋白酶对NRR的切割。研究团队利用嵌合Notch和DSL蛋白筛选发现，11种来源各异、序列和预测结构不同的结构域均可作为NRR替代物，其功能均依赖Kuz催化的切割和Epsin介导的内吞。这些发现揭示了ADAM10介导的力依赖性蛋白水解在细胞接触信号中的潜在广泛作用。

INTRODUCTION
接触依赖性信号依赖跨膜配体-受体形成细胞间桥梁。Notch作为典型代表，其激活需要DSL配体结合后引发ADAM10介导的胞外域切割（果蝇中为Kuz）。这一过程依赖Epsin介导的配体内吞产生的机械力，使NRR中隐藏的切割位点暴露。虽然此前发现海胆SEA结构域可在培养细胞中替代NRR，但体内环境下机械力传感的多样性仍不清楚。

RESULTS

体内筛选力敏感蛋白水解开关
研究构建了嵌合受体FSHR-Notch（用促卵泡激素受体FSHR替换Notch配体结合域），并用43种候选结构域替换NRR。通过"启动子交换镶嵌分析"（MAPS）技术在果蝇翅盘中建立配体（FSH-Dl）与受体表达细胞的界面，监测Notch靶基因cut的激活。结果显示：

• 8个结构域严格依赖配体激活（Class I）
• 3个对配体内吞需求较低（Class II）
• 3个兼具组成型活性和配体响应（Class III，超活性）
• 12个显示组成型激活
• 20个无活性

候选结构域的力敏感性特征
通过比较野生型、KtoR（无法内吞）和ΔIC（缺失胞内域）配体的激活效果发现：

• Class I（如DCC、EphB2、Serrate结构域）严格依赖Epsin内吞，类似天然NRR^Notch

• Class II（如Dscam1、Venus荧光蛋白）对Epsin需求较低

• Class III（如缺失LNR的NRR^ΔLNR
  ）在无配体时仍有微弱活性

Kuz蛋白酶依赖性验证
通过RNAi敲低Kuz证明：

• 所有配体依赖性受体（包括超活性）的激活均需Kuz
• 6个组成型激活受体中4个依赖Kuz，但Delta和EphrinB结构域例外

DISCUSSION
该筛选系统成功鉴定了结构多样的力敏感蛋白水解开关，包括神经元导向蛋白（DCC、Eph受体）和粘附分子（DAG1）等结构域。这些发现暗示：

1. 机械力可能通过暴露隐藏的Kuz切割位点实现调控
2. 不同结构域的力敏感性阈值存在差异（Epsin依赖程度不同）
3. 该技术可优化合成Notch受体（synNotch）设计
   研究还发现培养细胞与体内实验结果存在部分差异，强调生理环境下机械力传感验证的重要性。超活性受体NRR^ΔLNR
   的活性表明，仅保留切割位点的最小结构仍具力传感潜力，为设计微型化synNotch提供线索。