SARS-CoV-2刺突蛋白弗林蛋白酶切割位点对致病性而非传播性的关键作用解析

这篇研究通过构建弗林蛋白酶切割位点（FCS）突变体（PQQAR），揭示了SARS-CoV-2刺突蛋白中FCS对病毒致病性的决定性作用，同时发现其非传播必需性。实验表明，FCS破坏会减弱病毒在呼吸细胞中的复制（Calu-3细胞中降低3 log）、减少体内刺突蛋白加工（S1/S2切割产物减少40%），并改变宿主蛋白酶TMPRSS2 的利用途径。值得注意的是，尽管FCS缺失导致仓鼠模型致病性减弱（体重损失减少10%-12%），但病毒仍能通过直接接触传播（100%感染率），但竞争实验显示其传播效率显著低于野生型（NGS检测显示PQQAR在肺中仅占1.95%病毒读数）。该研究为评估人畜共患冠状病毒风险提供了关键分子标记。

　　

SARS-CoV-2刺突蛋白弗林蛋白酶切割位点的功能解析

ABSTRACT
SARS-CoV-2刺突蛋白的弗林蛋白酶切割位点（FCS，PRRAR序列）和延伸的S1/S2环（含上游QTQTN基序）是其区别于其他乙型冠状病毒的特征。研究通过构建FCS破坏突变体（PQQAR）发现，该突变虽保持S1/S2环长度，但导致刺突加工减少、病毒在呼吸细胞（Calu-3）中复制降低3 log，并在仓鼠模型中显著减弱致病性（体重损失减少10%-12%）。值得注意的是，PQQAR突变体仍可通过直接接触传播，但竞争实验显示其传播效率仅为野生型的1/162.7（肺组织NGS数据）。

INTRODUCTION
SARS-CoV-2持续流行的关键因素在于刺突蛋白的演化，而FCS和延伸S1/S2环在所有变异株中高度保守。刺突蛋白需要经历S1/S2和S2′两次切割才能激活膜融合。与SARS-CoV不同，SARS-CoV-2的FCS（RXXR基序）使其在病毒释放时即可被弗林蛋白酶部分切割。先前删除FCS（ΔPRRA）或QTQTN基序（ΔQTQTN）的研究均缩短了S1/S2环，导致病毒衰减，但未能区分环长度与FCS功能的独立作用。

RESULTS

PQQAR突变体的构建与表征
通过反向遗传学构建的PQQAR突变体将FCS的R682/R683替换为谷氨酰胺，维持S1/S2环长度但破坏FCS功能。该突变体在Vero E6细胞中复制正常（与WT无显著差异），但在人呼吸道上皮细胞（Calu-3 2B4）中复制显著受限（48 hpi病毒滴度降低3 log）。

体内致病性衰减
仓鼠感染实验显示，PQQAR突变体几乎不引起体重下降（WT组峰值下降12%），肺组织病毒抗原染色评分降低50%，病理损伤面积减少80%。有趣的是，突变体在上呼吸道（鼻洗液）的病毒载量反而比WT高10倍，提示感染趋向性改变。

刺突加工与蛋白酶利用机制
蔗糖梯度纯化病毒颗粒的Western blot显示，PQQAR突变体的S1/S2切割产物比例从WT的40%降至接近基线。在TMPRSS²
敲除的Calu-3细胞中，WT与突变体的复制差异消失，证实FCS通过调控TMPRSS²
介导的细胞表面途径影响感染效率。

传播能力的矛盾发现
直接接触传播实验中，所有PQQAR突变体感染的仓鼠均成功传播病毒（5/5），但受体动物肺组织病毒载量比WT组低2 log。竞争实验进一步揭示，在混合感染（WT:PQQAR=1:1）时，突变体在鼻洗液和肺中的病毒读数分别仅占8.63%和1.95%，表明FCS缺失虽非传播绝对屏障，但显著削弱竞争优势。

DISCUSSION
该研究首次在维持S1/S2环长度的前提下证实FCS对SARS-CoV-2致病性的独立贡献。FCS通过双重机制发挥作用：① 促进病毒释放前的刺突蛋白加工；② 优化TMPRSS²
介导的细胞进入途径。传播实验的发现挑战了此前关于FCS绝对必需性的认知（如雪貂模型结论），提示S1/S2环长度可能才是传播关键因素。这些发现为评估类似BANAL-236（具ACE2结合能力但缺乏FCS）的动物冠状病毒跨种风险提供了新维度。

MATERIALS AND METHODS
研究使用反向遗传学构建病毒（基于USA-WA1/2020株），通过聚焦形成试验（FFU）定量病毒滴度，仓鼠实验采用3-4周龄雄性叙利亚金仓鼠。组织病理学由盲法病理学家评估，NGS采用Tiled-ClickSeq方法（检测灵敏度达背景突变率的10倍以上）。所有操作在BSL-3实验室完成。