金黄色葡萄球菌噬菌体φ2638A内溶素异构体异源二聚化及其在细菌裂解中的功能机制研究

研究人员针对革兰氏阳性菌噬菌体内溶素（endolysins）在感染周期中短变体（SV）异构体的功能未知性问题，以金黄色葡萄球菌噬菌体φ2638A为模型，通过X射线晶体学和AlphaFold建模解析了其内溶素Ply2638A的结构与功能。研究发现SV异构体（Plysv ）与全长内溶素（PlyFL ）通过酰胺酶结构域（amidase）形成异源二聚体，协同促进细菌裂解和子代噬菌体释放。该研究揭示了I型内部翻译起始位点（iTSS）的进化保守意义，为开发新型抗菌药物提供了理论依据。

　　

研究背景与意义

在抗生素耐药性（AMR）危机日益严峻的背景下，噬菌体内溶素（endolysins）因其精准裂解革兰氏阳性菌细胞壁的能力成为抗感染治疗的新希望。这类酶通常具有模块化结构，包含催化活性域（EADs）和细胞壁结合域（CBDs）。有趣的是，许多内溶素基因含有内部翻译起始位点（iTSS），可同时表达全长（FL）和短变体（SV）异构体。尽管外源性应用内溶素的抗菌活性已被广泛研究，但SV异构体在噬菌体感染周期中的生物学功能仍是一个谜团。

苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）和苏黎世大学的研究团队以金黄色葡萄球菌噬菌体φ2638A的内溶素Ply2638A为模型，首次揭示了I型iTSS内溶素异构体间的功能协同机制。该研究发表于《microLife》，通过结构生物学和遗传学手段证明SV异构体通过酰胺酶结构域介导的异源二聚化，优化了细菌裂解效率，为理解噬菌体裂解系统的进化策略提供了新视角。

关键技术方法

研究团队采用基因工程改造噬菌体（沉默iTSS生成单异构体突变体），结合Western blot验证蛋白表达；通过X射线晶体学解析M23肽酶和SH3b结构域（PDB ID:6YJ1/7AQH），AlphaFold预测酰胺酶结构域模型；表面等离子共振（SPR）和尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）分析蛋白相互作用；浊度降低实验（TRA）和一步生长曲线评估裂解活性；荧光显微镜定量SH3b结构域与肽聚糖突变菌株的结合特性。

研究结果

噬菌体适应性需要双异构体协同表达

通过构建仅表达Ply_FL
或Ply_sv
的工程噬菌体，发现野生型（WT）噬菌体的裂解效率显著高于单异构体突变体。一步生长曲线显示WT噬菌体子代释放更早（指数增长系数3.330 vs. 0.844/0.408），但最终滴度无差异，表明双异构体系统优化了裂解时序而非产量。

异源二聚体通过酰胺酶结构域相互作用

SEC-MALS证实Ply_FL
与过量Ply_sv
形成97 kDa异源二聚体（单体理论值55.5/35.3 kDa）。SPR显示仅含酰胺酶结构域的蛋白能与固定化Ply_FL
结合，而M23或CBD结构域无此特性，揭示相互作用界面位于酰胺酶区域。

结构解析揭示底物识别特性

晶体结构显示M23肽酶的底物结合沟槽被34残基的Loop1和15残基的Loop4延长，这种独特构象可能影响其对D-Ala-Gly键的切割特异性。SH3b结构域与溶葡球菌酶（lysostaphin）相似，通过双位点识别肽聚糖交联桥和肽茎。AlphaFold模型显示酰胺酶结构域具有保守的锌离子结合位点（His₂₀₆
/His₃₁₄
/Cys₃₂₂
）和催化谷氨酸（Glu₂₇₀
）。

结论与讨论

该研究首次阐明I型iTSS内溶素中SV异构体（SVEAD-CBD）的功能优势：通过异源二聚化增强酰胺酶活性，协同M23肽酶加速高度交联的葡萄球菌肽聚糖降解。这种机制解释了为何含M23-酰胺酶-CBD架构的内溶素保留iTSS，而CHAP-酰胺酶-CBD型内溶素（如LysK）通常缺失该位点——后者的酰胺酶活性较弱，SV异构体无法提供显著优势。

研究成果为设计新型抗葡萄球菌药物提供了重要启示：① 异源二聚化界面可作为药物增效靶点；② M23肽酶的特异性Loop区域可指导工程改造；③ 双异构体系统在噬菌体治疗中的时序调控价值。作者团队基于Ply2638A scaffold已开发出临床候选药物XZ.700，证实了该模型的应用潜力。未来需进一步解析异源二聚体的原子结构，并探索该机制在其他病原体中的普适性。