基于鲨鱼源单域抗体的荧光免疫层析技术快速检测鱼糜中鸭卵清蛋白(D-OVA)

本研究针对鱼糜制品中鸭卵清蛋白(D-OVA)过敏原快速检测需求，开发了基于鲨鱼源单域抗体(VNAR)的荧光免疫层析试纸条(D-OVA-FITS)。通过噬菌体展示技术筛选特异性VNAR，构建量子点标记的竞争法检测体系，实现15分钟内0.04 μg/mL的检测限(IC50 0.3 μg/mL)，为食品过敏原监管提供了高灵敏便携解决方案。

　　

在鱼糜制品的生产过程中，添加鸭蛋清蛋白已成为提升凝胶强度的常见工艺，但其中主要过敏原鸭卵清蛋白(D-OVA)可能引发严重的IgE介导过敏反应。传统检测方法如ELISA和LC-MS/MS存在耗时长、设备昂贵等局限，而市售抗体对热处理后变性的D-OVA识别能力不足。更棘手的是，随着脱盐技术的发展，原本被废弃的咸鸭蛋清正被重新利用，这使得过敏原监管面临新挑战。

为解决这一技术瓶颈，集美大学的研究团队创新性地将鲨鱼源单域抗体(VNAR)应用于荧光免疫层析检测系统。通过噬菌体展示技术从白斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum
)文库中筛选出特异性VNAR，并建立HEK293F细胞表达体系，最终开发出量子点标记的D-OVA-FITS检测试纸条。

关键技术包括：1) 离子交换色谱纯化D-OVA并经质谱验证；2) 噬菌体展示筛选与BLI亲和力验证获得14A2/14A8两个高特异性VNAR；3) 量子点(QDs)标记构建竞争法检测体系；4) 实际鱼糜样本验证。

研究结果
材料与试剂
研究采用本地市售鸭蛋和安井食品集团提供的冷冻鱼糜，关键材料包括QD荧光标记物、EDC交联剂等均由厦门博生生物科技有限公司提供。

D-OVA纯化鉴定
通过DEAE-Sepharose阴离子交换柱，在0.15 M NaCl洗脱条件下获得高纯度D-OVA。质谱鉴定显示其分子量为45 kDa，SDS-PAGE检测发现其存在40 kDa单体与80 kDa二聚体形式。

单域抗体特性
Western blot证实14A2和14A8能特异性识别天然/变性D-OVA。BLI分析显示二者亲和力达nM级，其中14A2的K_D
值为3.72×10^-8
M，被选为检测抗体。

试纸条性能
D-OVA-FITS在15分钟内完成检测，线性范围0.01-10 μg/mL，LOD低至0.04 μg/mL，IC₅₀
为0.3 μg/mL。加标回收试验显示鱼糜基质中回收率达92.3-107.8%，与LC-MS/MS结果高度一致。

结论与意义
该研究首次将鲨鱼源VNAR应用于食品过敏原检测领域，所开发的D-OVA-FITS具有三大创新点：1) 纳米抗体对加工食品中变性抗原的高识别能力；2) QD标记实现超灵敏检测；3) 适于基层监管的便携式设计。这项由张玲静等学者完成的工作，为《食品化学》(Food Chemistry
)提供了食品过敏原快速检测的新范式，同时为咸鸭蛋清副产物的安全利用提供了技术保障。研究获得福建省重点实验室(编号FJKLRCAPP2024-01)和中国轻工业联合会(编号ETRCRCAP2024-02)的资助支持。