VIM型金属β-内酰胺酶活性位点邻近残基突变通过间接调控D-卡托普利相互作用削弱其抑制效果

为解决日益严峻的抗生素耐药问题，研究人员针对VIM家族金属β-内酰胺酶（MBLs）的抑制机制展开研究。通过酶动力学分析和X射线晶体学技术，发现D-卡托普利对VIM-2、VIM-15和VIM-20的抑制效果显著优于L-卡托普利，但VIM-31因Y201H突变导致活性位点邻近的Ser-207构象变化，间接削弱D-卡托普利与Arg-205的静电相互作用，使其抑制效能降低10倍。该研究揭示了MBLs进化中远端突变对抑制剂结合的间接影响，为广谱抑制剂设计提供新思路。

　　

抗生素耐药已成为全球公共卫生的重大威胁，其中β-内酰胺类抗生素的失效尤其令人担忧。这类抗生素被细菌产生的β-内酰胺酶（BLs）分解，其中金属β-内酰胺酶（MBLs）因能水解碳青霉烯类"最后防线"抗生素而备受关注。Verona整合子编码的金属β-内酰胺酶（VIM）是最常见的MBLs之一，已发现92种变异体。尽管已有针对丝氨酸β-内酰胺酶（SBLs）的抑制剂上市，但尚无MBLs抑制剂获批临床应用。

在此背景下，研究人员聚焦VIM家族中四个密切相关的变异体：VIM-2及其单点突变体VIM-15（Y195F）、VIM-20（H229R）和双突变体VIM-31（H229R/Y201H）。前期研究发现D-卡托普利对VIM-2的抑制效果优于L-卡托普利，但不同变异体间的抑制差异机制尚不明确。

研究团队采用多学科技术手段展开系统研究。通过PAR比色法测定锌离子结合量，证实所有VIM变异体均为双锌离子酶；利用稳态动力学分析比较不同锌离子浓度下的催化效率；采用IC₅₀
测定评估四种硫醇类药物（L/D-卡托普利、DL-硫奥芬和2,3-二巯基丙醇）的抑制效能；最终通过X射线晶体学解析VIM-20、VIM-31和VIM-15与卡托普利异构体的复合物结构，分辨率达1.29-1.57 ?。

3.1 蛋白质表达与纯化
成功表达纯化四种VIM变异体，TEV蛋白酶切除His标签后获得高纯度（>95%）蛋白，产量17-29 mg/L。SDS-PAGE显示分子量与预测值相符（约25.8 kDa）。

3.2 锌离子结合定量
PAR分析显示，天然状态下各VIM变异体平均结合0.76个Zn²⁺
，经变性后升至2.1-2.3个，证实活性位点含两个Zn²⁺
，其中一个结合较弱。

3.3 稳态动力学
以硝基西林为底物，发现VIM-20因H229R突变形成Arg229-Glu171盐桥，具有最低K_M
值（98 μM）；而VIM-31因Y201H突变获得最高k_cat
值（338 s^-1
）。锌离子浓度升高会提高k_cat
但降低底物亲和力，总体催化效率保持稳定。

3.4 IC₅₀
测定
D-卡托普利对VIM-2、VIM-15和VIM-20的IC₅₀
值（1.2-5.8 μM）显著低于L-卡托普利（19-26 μM），但对VIM-31的抑制效果骤降10倍（29 μM），与L-卡托普利相当。2,3-二巯基丙醇对所有变异体均有较强抑制（3.7-22 μM）。

3.5 X射线晶体学
结构解析揭示关键机制：在VIM-2和VIM-20中，D-卡托普利羧酸基与Arg205形成静电相互作用，而VIM-31因Y201H突变导致Ser207位移2.9 ?，破坏其与Arg205的氢键网络，使Arg205无法稳定D-卡托普利。这解释了VIM-31中D-卡托普利抑制效能降低的现象。

该研究首次阐明VIM家族酶活性位点邻近残基（如201位）突变可通过间接调控关键相互作用（Arg205构象）影响抑制剂结合。这一发现突破了传统"活性中心靶向"的药物设计思路，提示MBLs抑制剂开发需考虑远端突变引起的变构效应。鉴于VIM变异体在全球临床分离株中的高流行率（如ICU中VIM阳性铜绿假单胞菌感染死亡率达51%），该研究为设计广谱VIM抑制剂提供了重要结构依据。特别是D-卡托普利作为潜在"泛VIM抑制剂"的先导化合物，其优化设计应关注对Arg205相互作用的稳定性，以应对不断进化的耐药突变。