高效大片段DNA跨微生物递送新方法CELyTED：无需体外纯化的通用转化技术

本研究针对大片段DNA在传统纯化过程中易受剪切损伤的难题，开发了基于宿主细胞裂解的直接转化技术CELyTED。研究人员利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）自发裂解特性，成功将>50 kb的质粒DNA递送至大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），通过优化裂解条件并添加核酸酶抑制剂ATA、Exo I和蛋白酶K，显著提升转化效率。该技术为合成基因组学提供了无需体外纯化的通用DNA递送平台。

　　

在合成生物学蓬勃发展的今天，科学家们正尝试构建包含多个基因甚至完整基因组的大型DNA分子。然而，这些"基因巨构"在溶液中的脆弱性成为重大挑战——就像一根超长的细线容易在流动中断裂，DNA分子也会因流体剪切力而破碎。传统解决方案是将DNA构建过程限制在微生物细胞内完成，但将合成好的大片段DNA转移到目标细胞时，常规的体外纯化步骤又会带来新的损伤风险。这种两难境地促使科学家们寻找更温和高效的DNA递送方法。

日本研究人员在《Journal of Molecular Biology》发表的研究中，开发了一种名为CELyTED（细胞裂解技术提供可转化胞外DNA）的创新方法。他们巧妙利用枯草芽孢杆菌168trpC2
菌株的自发裂解特性，将携带质粒的宿主细胞裂解液直接用于大肠杆菌和酿酒酵母的转化，成功实现了15.5-70 kb大片段DNA的无纯化递送，为合成基因组学研究提供了重要技术支撑。

研究团队采用了几项关键技术：首先利用枯草芽孢杆菌的自溶酶系统实现温和裂解；其次通过添加核酸酶抑制剂ATA（Aurintricarboxylic acid）和Exo I（Exonuclease I）保护DNA完整性；再结合蛋白酶K处理降低蛋白杂质干扰；最后优化了裂解液与受体细胞的比例（1:20）。对于酵母转化，采用商业化的锂离子转化试剂盒进行处理。所有实验菌株均来自标准保藏中心，包括大肠杆菌DH10B和酿酒酵母YPH499等模式菌株。

【RESULTS各部分研究发现】

"B. subtilis裂解释放的胞外DNA质粒可实现E. coli转化"部分证实，采用Super broth培养基培养的供体菌裂解液，配合ATA+proK联合处理，能使15.5 kb的pGETS302质粒转化效率提升3倍。电镜观察显示，裂解2小时后菌体完全破碎，释放出完整质粒DNA。

"利用B. subtilis裂解液转化S. cerevisiae"部分显示，该技术成功将含LEU2标记基因的穿梭质粒导入酵母细胞。通过长片段PCR和限制性酶切验证，获得的转化子携带完整质粒，且转化效率与质粒大小呈负相关。

"高效质粒DNA递送的最优条件确定"部分揭示，ATA和proK的协同作用对转化效率提升至关重要。Super broth培养的供体菌裂解液转化效果显著优于LB培养基，说明高密度培养有利于DNA释放。

"大片段DNA质粒向E. coli或S. cerevisiae的递送"部分突破性地证明，该方法可递送44.7 kb的pGETS302B和70 kb的pUB307BBB等超大质粒。值得注意的是，70 kb质粒通过电转导入大肠杆菌的效率反而低于化学转化，提示大DNA分子对电击更敏感。

在讨论部分，作者强调CELyTED技术的三大优势：首先，枯草芽孢杆菌的自发裂解特性避免了噬菌体诱导裂解的复杂优化；其次，规避体外纯化步骤可最大限度保持DNA完整性；最重要的是，该方法在细菌和真核系统间建立了通用转化桥梁。与传统的BAC（细菌人工染色体）和YAC（酵母人工染色体）技术相比，CELyTED更适合脆弱大片段DNA的跨物种转移。

这项研究的意义不仅在于技术革新，更为合成基因组学提供了关键方法学支撑。当与OGAB（Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis）等大片段组装技术联用时，CELyTED可形成从DNA合成到递送的完整技术链条。未来，若能将类似裂解技术拓展至酿酒酵母等真核供体，将进一步完善合成生物学研究工具集。该成果标志着微生物间DNA转移技术进入"无纯化"新时代，为人工基因组构建等前沿研究铺平了道路。