基于纠错新一代测序与基准剂量分析的N-亚硝基-比索洛尔安全限值研究：整合量子力学模型与CYP对接分析

本研究通过纠错新一代测序（ecNGS）和基准剂量（BMD）分析，结合量子力学（QM）建模与CYP对接技术，首次系统评估了N-亚硝基-比索洛尔（NBP）的致突变性。突破性地发现NBP在增强型艾姆斯试验（EAT）中仅在高浓度诱导仓鼠S9条件下显示弱致突变性，而体内实验揭示其BMDL50 达96 mg/kg/day，显著高于传统CPCA框架设定的1.5 μg/day限值。研究提出400 μg/day的终身允许日暴露量（PDE）和64 μg/day的可接受摄入量（AI），为β受体阻滞剂类NDSRIs的风险评估提供了数据驱动的科学范式。

　　

引言：N-亚硝基化合物的监管挑战

N-亚硝基化合物作为ICH M7指南定义的"关注队列"致癌物，自2018年缬沙坦事件后引发全球药品监管风暴。其中N-亚硝基-比索洛尔（NBP）作为β₁
选择性阻滞剂比索洛尔的衍生物，其分子结构中羟基与仲胺基团构成亚硝化风险位点。现行基于致癌效能分类方法（CPCA）设定的1.5 μg/day限值缺乏实验数据支持，促使本研究采用多维度技术路线重新评估。

材料与方法：创新性技术整合

研究设计包含三个关键模块：

1. 体外致突变性检测：采用增强型艾姆斯试验（EAT）标准，测试10-30%诱导大鼠/仓鼠S9代谢条件下的致突变性；V79细胞HPRT基因突变试验验证哺乳动物细胞效应
2. 体内28天重复给药实验：选用NMRI野生型雌鼠（基于3R原则），剂量覆盖9.95-845 mg/kg/day，采集肝/骨髓组织进行双链测序（DS）
3. 计算毒理学模型：CADRE平台整合量子力学（mPW1PW91/MIDIX+理论水平）与CYP 2A6/3A4对接模拟，预测α-C反应活性与代谢差异

结果与讨论：突破性发现

体外数据矛盾性：

• 标准艾姆斯试验阴性，但EAT在30%诱导仓鼠S9条件下TA100/TA1535菌株突变频率显著提升（p<0.05），证实弱致突变物检测需苛刻条件
• HPRT试验中NDEA阳性对照诱导42.6突变克隆/10⁶
  细胞，而NBP未显示效应，揭示体外哺乳细胞模型对复杂NDSRIs灵敏度局限

ecNGS技术优势：
双链测序实现10^-8
突变频率检测精度，较传统转基因啮齿动物（TGR）检测具有三大突破：

1. 野生型动物适用性避免转基因干扰
2. 全基因组覆盖揭示突变特征谱
3. 骨髓样本显示剂量依赖性突变增长（845 mg/kg组2.4倍，p<0.0001）

BMD建模关键结论：

• 肝脏BMDL₅₀
  为96 mg/kg/day，较NDEA（0.04 mg/kg/day）弱2400倍
• 突变特征谱分析显示C>T/T>G主导（占比>60%），与O⁶
  -烷基鸟嘌呤/O⁴
  -烷基胸腺嘧啶损伤修复机制一致
• 低剂量组（≤29.85 mg/kg）突变谱与对照组无差异，支持MGMT修复阈值机制

CADRE模型验证：
QM计算显示NBP的α-C Fukui函数值（f⁺
=0.12）显著低于NDEA（0.31），结合CYP 2A6对接中3.5?催化距离，共同解释其低代谢活性。预测TD₅₀

1.5 mg/kg/day，支持非COC分类。

安全限值重构

基于BMDL₅₀
和12,000倍不确定系数，推导出：

• PDE=400 μg/day（ICH Q3C框架）
• AI=64 μg/day（以NDEA为锚定物）
  该数值较CPCA限值提升42倍，但仍在29.85 mg/kg HED（120 mg）的300倍安全边际内。

行业启示与展望

本研究确立ecNGS作为NDSRIs评估的新金标准，其优势在于：

1. 6周内完成传统TGR需6个月的检测
2. 单实验同时获得突变频率、特征谱和BMD数据
3. 支持β受体阻滞剂类NDSRIs的交叉限值设定
   未来需扩大锚定化合物库（如NMOR、NPYR）以提高AI计算普适性，推动监管框架从保守预测向数据驱动转型。