基于多酶恒温快速扩增与侧流层析技术联用的HTLV-1前病毒DNA检测方法的开发与验证

本研究针对HTLV-1（人类T细胞白血病病毒1型）感染诊断的时效性与准确性难题，开发了一种结合多酶恒温快速扩增（MIRA）与侧流层析试纸条（LFD）的新型检测技术。研究人员通过靶向HTLV-1 Tax基因保守区设计引物探针，建立可在37℃、20分钟内完成检测的方法，灵敏度达200拷贝/μL，与qPCR相比具有100%一致性。该技术为基层医疗机构和血站提供了快速、便携的筛查方案，对阻断HTLV-1经血传播具有重要意义。

　　

HTLV-1检测的困境与突破
人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）是首个被发现的人类逆转录病毒，全球约1000-2000万人感染，可引发成人T细胞白血病（ATL）和热带痉挛性截瘫（HAM/TSP）等致命疾病。其传播主要依赖血液、母婴和性接触途径，其中输血传播尤为突出。然而现有检测手段面临严峻挑战：抗体检测（ELISA）存在窗口期长、假阳性率高的问题，而核酸检测虽准确却依赖昂贵设备，难以在资源有限的地区推广。

针对这一技术瓶颈，浙江大学医学院附属第一医院的研究团队在《Journal of Translational Medicine》发表创新成果，开发出基于多酶恒温快速扩增（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）与侧流层析试纸条（Lateral Flow Dipstick, LFD）联用的检测体系。该方法突破传统PCR对精密仪器的依赖，实现"水浴锅+试纸条"的极简操作模式，为HTLV-1的现场筛查提供全新解决方案。

关键技术方法
研究团队从500例临床样本中提取核酸，针对HTLV-1高度保守的Tax基因设计4组引物探针，通过筛选确定最优组合HTLV-1-1。采用DNA恒温快速扩增试剂盒建立反应体系，在37℃恒温条件下完成核酸扩增后，通过标记6-FAM（6-羧基荧光素）和生物素的扩增产物与LFD试纸条特异性结合实现可视化判读。以实时荧光定量PCR（qPCR）为金标准进行方法学验证。

研究结果
引物探针验证与优化
通过四组引物探针（HTLV-1-1至HTLV-1-4）的平行测试，发现HTLV-1-1组在保证检测灵敏度的同时完全避免非特异性扩增（图4）。该组引物靶向Tax基因7722-8084区段，扩增产物长度363bp，探针设计采用6-FAM/THF（四氢呋喃）/C3间隔子的特殊结构（图2）。

反应条件确立
温度梯度实验显示37℃和42℃均可有效扩增，但37℃更利于现场应用（图5A）。时间优化证实15分钟即可完成扩增，延长反应时间不显著增强信号（图5B）。

灵敏度与特异性
对梯度稀释的HTLV-1质粒检测显示，该方法最低可检出200拷贝/μL（图6）。在HBV、HCV、EBV等8种常见病原体检测中均无交叉反应（图7），证明其高度特异性。

临床验证
500例临床样本检测显示，MIRA-LFD与qPCR结果完全一致（kappa=1.00），7例阳性样本全部检出，诊断敏感性和特异性均达100%（表2）。

研究结论与意义
该研究首创的MIRA-LFD技术将HTLV-1检测时间压缩至20分钟，灵敏度媲美qPCR，且操作简便、成本低廉。其创新性体现在：

1. 首次将MIRA技术应用于HTLV-1检测，通过多酶协同（重组酶/SSB蛋白/DNA聚合酶）实现常温高效扩增；
2. 探针设计采用THF位点被核酸外切酶IV（nfo）识别的机制（图1），结合双标记（6-FAM/生物素）实现LFD可视化读取；
3. 突破实验室限制，仅需水浴锅和试纸条即可完成检测，适合血站和基层单位推广。

这项技术为HTLV-1的早期筛查和流行病学监测提供有力工具，尤其对输血安全防控具有重要价值。研究者特别指出，该方法检测的是整合于白细胞基因组的前病毒DNA而非RNA，具有更好的样本稳定性和临床适用性。未来可进一步开发为试剂盒，推动HTLV-1防控的普惠化进程。