双神经肽信号通路调控雄性蟋蟀交配后不应期与生殖系统的分子机制

本研究针对雄性昆虫交配后精确计时的不应期机制这一科学难题，通过RNA干扰、原位杂交等技术，发现Allatotropin(AT)和short neuropeptide F(sNPF)两条神经肽信号通路分别调控雄性蟋蟀(Gryllus bimaculatus)1小时不应期终止及生殖系统功能。研究首次揭示AT通过刺激雄性附腺(MAG)收缩促进精液分泌，sNPF通过调控储精囊(SVs)精子储存影响雌性生殖行为，为昆虫生殖行为调控提供了新见解。论文发表于《Communications Biology》。

　　

在昆虫繁殖领域，雄性交配后为何会进入特定时长的不应期(refractory stage, RS)一直是个有趣的谜题。与雌性昆虫通过接收雄性物质调控不应期不同，雄性蟋蟀(Gryllus bimaculatus)展现出精确计时的1小时不应期，这种"生物计时器"由终端腹神经节(terminal abdominal ganglion, TAG)控制，但分子机制尚不明确。同时，雄性生殖系统需要在不应期内完成精荚(spermatophore)制备，包括从雄性附腺(male accessory gland, MAG)分泌精液和从储精囊(seminal vesicles, SVs)运输精子，这些过程如何被调控也亟待探索。

日本的研究人员Zhen Zhu和Shi
nji Nagata在《Communications Biology》发表的研究，通过系统筛选TAG中28种神经肽前体，发现Allatotropin(AT)和short neuropeptide F(sNPF)两条信号通路协同调控这一精密系统。研究采用RNA测序、RT-qPCR和原位杂交鉴定雄性特异性表达的神经肽；通过RNA干扰(RNAi)结合行为学观察分析不应期变化；利用离体器官培养和显微注射验证神经肽功能；采用免疫组化和质谱确认神经肽分布；结合精子计数和生殖行为评估解析生理影响。

Myosuppressin, AT, DH31和sNPF在TAG中呈现雄性特异性表达
RNA测序鉴定出TAG中28种神经肽前体，其中myosuppressin、AT和sNPF在雄性中表达显著更高。原位杂交显示这些神经肽阳性细胞集中分布于雄性TAG背侧中线，形成后中区和底中区两个神经细胞簇，而雌性中未见类似分布。发育分析表明这些神经肽从倒数第二龄若虫期开始雄性特异性上调，暗示其参与雄性特异性生理事件。

AT和sNPF信号通路调控雄性交配后不应期时长
RNAi实验显示，敲低AT或sNPF使不应期分别延长8.5和9.5分钟，交配频率显著降低；其受体ATR和sNPFR敲低也产生类似表型。双敲实验表明两条通路平行作用。值得注意的是，切除MAG/SVs复合体不影响不应期时长，说明精荚制备过程并非不应期计时决定因素。多次交配后TAG中AT转录水平下降，而脑部受体表达上调，提示存在反馈调节。

AT和sNPF共定位于TAG特定神经元但靶向不同生殖组织
免疫组化与原位杂交双标显示，AT肽与sNPF mRNA共表达于TAG背侧中线直径约40μm的大细胞中，可能协同调控不应期；而直径约15μm的小细胞中分别特异性表达AT或sNPF，可能分别调控MAG和SVs。受体分布分析证实ATR主要在MAG高表达，sNPFR则在输精管和SVs富集。

AT信号通路通过刺激MAG收缩促进精液分泌
AT/ATR敲除使多次交配雄性的MAG重量显著增加，提示精液分泌受阻。离体实验显示合成AT肽以剂量依赖方式刺激MAG小管收缩和精液分泌，24μM AT使分泌量增加3倍，该效应可被细胞松弛素D(肌动蛋白聚合抑制剂)阻断。发育分析显示ATR表达与MAG形态变化同步增强，支持其对腺体功能的调控。

sNPF信号通路促进SVs精子储存并影响雌性生殖行为
sNPF/sNPFR敲除使SVs精子数量减少40%，但不影响精荚中精子数量，表明其特异性调控储存而非运输。有趣的是，与sNPF信号缺陷雄性多次交配的雌性产卵量减少30%，再交配时间延长1倍，暗示雄性可能通过SVs分泌某种类似性肽(sex peptide)的物质调控雌性行为。

这项研究首次阐明AT和sNPF双通路协同调控昆虫雄性生殖的分子机制：AT通过激活MAG收缩确保精液分泌，sNPF通过促进SVs精子储存影响雌性生殖，二者共同精确控制1小时不应期的终止。该发现不仅为昆虫生殖行为计时机制提供新见解，其揭示的神经肽多效性调控模式——同一神经肽在不同细胞中调控不同生理过程，也为神经系统功能研究提供了范式。特别值得注意的是，sNPF信号通路影响雌性接受性的发现，为昆虫跨性别生殖调控提供了新视角。研究采用的从行为观察到分子机制的多层次解析策略，也为复杂行为神经基础研究提供了方法学参考。