工程化调控丙二酰辅酶A水平增强聚酮化合物生物合成的创新策略

本研究针对大肠杆菌中丙二酰辅酶A(M-CoA)供应不足限制聚酮化合物(PKS)生产的瓶颈问题，通过构建正交的MatBC代谢通路并结合适应性实验室进化(ALE)，实现了M-CoA水平的精确调控。研究人员开发了生物素营养缺陷型菌株，通过外源添加丙二酸实现生长与代谢的耦合控制，使M-CoA产量提升18.1倍，甲基丙二酰辅酶A(mM-CoA)衍生的聚酮产物比例显著优化。该研究为微生物高效合成高价值天然产物提供了新范式。

　　

在微生物制药领域，聚酮化合物(Polyketides, PKS)作为重要的次级代谢产物，具有抗生素、抗肿瘤和免疫抑制等多种生物活性。然而，当这些天然产物的生物合成途径被转移到工业常用宿主大肠杆菌(Escherichia coli)时，往往面临关键前体物质供应不足的瓶颈问题。其中，丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA, M-CoA)作为聚酮链延伸的核心底物，其细胞内浓度受到严格调控，主要被竞争性分流至脂肪酸合成途径，导致聚酮产量低下。更复杂的是，许多工程化PKS对底物选择性存在"门控"现象，即使通过传统方法增加M-CoA库，也难以保证其有效掺入终产物。这些挑战严重制约了微生物细胞工厂在药物合成中的应用潜力。

针对这一关键科学问题，来自美国劳伦斯伯克利国家实验室等机构的研究团队在《Nature Chemical Biology》发表创新性研究成果。研究人员通过系统改造大肠杆菌的M-CoA代谢网络，构建了可精确调控的正交生物合成途径，并结合适应性进化策略，成功突破了聚酮生物合成的底物限制。该研究不仅提供了高效的工程菌株构建方法，还深入解析了M-CoA代谢调控机制，为复杂天然产物的微生物合成开辟了新途径。

研究团队主要运用了以下关键技术：1)基因组整合技术构建MatBC正交代谢通路；2)生物素营养缺陷型菌株开发实现代谢开关控制；3)适应性实验室进化(ALE)筛选高产突变体；4)液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)定量分析酰基辅酶A和聚酮产物；5)气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定脂肪酸谱；6)蛋白质组学分析进化菌株的代谢重编程特征。

工程化丙二酸转运系统优化
研究人员首先比较了三种丙二酸转运体(MadLM、MdcF和MatC)在大肠杆菌中的表达效果。通过将转运体与M-CoA连接酶MatB共表达，并以III型PKS RppA催化的红色色素flaviolin产量为指标，发现来自Rhizobium trifolii的MatC系统在提高M-CoA可用性方面表现最优，且无显著生长抑制。将matB和matC基因整合至基因组安全位点后，工程菌K207-3-MatBC在20 mM丙二酸条件下，flaviolin产量较对照提升70%。

模块化PKS底物选择性调控
在含有pikromycin PKS杂合系统的菌株中，研究人员通过替换第二或第三模块的酰基转移酶(AT)结构域，考察了M-CoA与甲基丙二酰辅酶A(mM-CoA)的掺入效率。LC-MS分析显示，在MatBC工程菌中补充丙二酸可显著提高M-CoA衍生产物比例。特别是第三AT模块改造菌KCP3-MatBC，其M-CoA产物(2)与mM-CoA产物(1)的比例达到5.3:1，较对照提升150倍，证实增加M-CoA库能有效克服PKS的底物偏好性。

构建生物素营养缺陷型调控系统
通过删除生物素合成基因bioH并整合MatBC通路，研究人员开发了生长依赖外源丙二酸的菌株BAP1-ΔbioH-MatBC。该菌株在M9培养基中，仅当添加≥1 mM丙二酸时才能恢复生长。LC-MS检测显示，在100 mM丙二酸条件下，M-CoA水平达到436.9±57.5 nM，按细胞干重计算较野生型提高18.1倍。相应地，工程菌的总脂肪酸含量也显著增加，其中C16脂肪酸提升最为明显。

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C标记聚酮的专一性生产
利用生物素营养缺陷型菌株，研究人员实现了全标记¹³
C聚酮的高纯度生产。当仅添加[¹³
C]丙二酸时，flaviolin的质谱峰显示5个¹³
C原子掺入，纯度达99.8%。而同时补充生物素会导致未标记产物的出现，证实正交通路能有效隔离内源性与外源性M-CoA合成途径。这种标记策略为代谢示踪研究提供了高性价比的解决方案。

适应性进化揭示代谢优化机制
通过长达4周的ALE实验，研究人员获得了23个具有不同突变特征的进化菌株。全基因组测序发现这些菌株普遍存在lac操纵子突变，导致MatBC表达上调。代表性突变包括：β-氧化相关基因(atoB、fadI)失活减少M-CoA消耗；铁转运基因(entF、fepE)突变可能激活乙醛酸分流途径；多糖合成基因(cpsG、manC)突变减少碳源分流。蛋白质组分析显示，高产菌株E2_S3中MatB和MatC表达分别上调3.9和3.6倍，同时β-氧化酶和乙醛酸途径酶(AceB)显著增加，表明代谢流已系统性重定向至M-CoA合成。

这项研究通过创新性地结合正交代谢工程与定向进化策略，成功解决了限制微生物聚酮生产的核心难题。所开发的生物素/M-CoA双调控系统不仅实现了前体供应的精确控制，还兼具同位素标记专一性生产的独特优势。适应性进化过程中发现的新颖突变位点，为后续代谢工程提供了重要靶点。特别值得注意的是，该研究揭示的代谢调控规律——包括β-氧化抑制、铁代谢调控与乙醛酸分流激活等机制——可能普遍适用于其他乙酰辅酶A衍生天然产物的微生物合成。这些发现将推动微生物制药从经验导向向理性设计转变，加速高价值化合物的产业化进程。