一步法环介导等温扩增技术特异性检测海分枝杆菌的创新方法及其诊断价值

本研究开发了一种基于环介导等温扩增（LAMP）技术的海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）特异性检测系统，通过靶向基因组独特序列MMRN_19150基因，实现了60分钟内可视化判读结果。该方法无需复杂仪器，灵敏度达2 pg/μL，可精准区分海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌（M. ulcerans）等皮肤非结核分枝杆菌（NTM），为临床快速诊断提供了突破性解决方案。

　　

研究背景与技术突破

海分枝杆菌作为皮肤非结核分枝杆菌（NTM）感染的主要病原体，与溃疡分枝杆菌在临床症状和流行病学特征上高度相似，但现有诊断依赖耗时的16S rRNA测序。本研究创新性地开发了一步法LAMP检测系统，通过比较基因组分析锁定海分枝杆菌特有基因MMRN_19150，设计特异性引物，实现了无需复杂设备的快速可视化检测。

方法学优化与验证

引物设计与靶标筛选
通过Mauve软件比对海分枝杆菌ATCC 927与溃疡分枝杆菌ATCC 19423基因组，筛选出仅存在于海分枝杆菌的MMRN_19150基因（编码假设蛋白）。经BLASTn验证后，使用Primer Explorer V5设计6条引物（F3/B3/FIP/BIP等），并通过限制性内切酶Aor51HI消化验证扩增特异性。

反应条件精准调控
实时荧光监测显示60°C为最佳反应温度，40分钟内即可完成扩增。羟基萘酚蓝（HNB）显色体系使结果可通过溶液颜色变化（紫→蓝）直观判读，灵敏度较实时PCR提升10倍（2 pg/μL vs 20 pg/μL）。

特异性与临床应用价值

严格的特异性验证
测试43株海分枝杆菌临床分离株均呈阳性，而溃疡分枝杆菌（含非洲、大洋洲等地理株）、其他NTM（如偶发分枝杆菌）及皮肤常见细菌（如金黄色葡萄球菌）均为阴性。值得注意的是，鱼源性病原体假肖氏分枝杆菌（M. pseudoshottsii）因基因同源性出现交叉反应，但该菌不感染人类，不影响临床适用性。

诊断流程革新
相比传统培养（需2周）和测序分析，本方法可直接使用菌落裂解液，60分钟内完成检测，且无需开放反应管或电泳验证。在三个独立实验室使用不同品牌设备验证结果一致性，证实其操作稳定性。

科学意义与治疗指导

海分枝杆菌对异烟肼等一线抗结核药物天然耐药，而溃疡分枝杆菌引起的布鲁里溃疡（Buruli ulcer）需特定抗生素组合治疗。本技术可精准区分这两种病原体，避免误诊导致的治疗延误。此外，其独立于IS₂₄₀₄
和分枝内酯（mycolactone）相关基因的检测策略，克服了现有分子标记物的局限性。

技术局限与展望

当前研究在严格控制的环境下完成，未来需通过多中心临床样本验证实际应用稳定性。该方法为资源有限地区提供了NTM诊断新工具，其模块化设计可扩展至其他病原体检测体系的开发。

材料与方法精要

实验采用日本微生物保藏中心（JCM）和美国菌种保藏中心（ATCC）的标准菌株，通过热裂解法快速制备DNA模板。LAMP反应体系含Betaine（1.6 M）和HNB（120 μM），电泳验证使用E-Gel预制胶系统，确保实验可重复性。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持内容）