菜心减数分裂相关基因BrASY2参与植株耐热性的功能分析

　　

摘要：

【目的】 菜心属于不耐热、喜冷凉的蔬菜，高温是夏秋菜心生产中面临的主要问题之一。实验室前期在菜心高温胁迫转录组数据库中挖掘到一个可能与高温胁迫响应相关的基因片段，将其命名为减数分裂相关基因BrASY2。通过进一步研究其理化性质、蛋白结构、系统进化及表达特性，并探究其在耐热性调控中的功能，以期为耐热菜心分子育种提供参考。【方法】 采用全基因合成的方法获得BrASY2全长，利用ExPASy ProtParam、ProtScale、SignalP-5.0、SOPMA、Swiss-Model和PlantCARE对其理化性质、信号肽、蛋白结构、顺式作用元件进行分析，使用MEGA 6.0构建系统发育树，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析其在高温胁迫下的表达特性。分别构建酵母异源超表达载体pYES2-NTB-BrASY2和基因沉默表达载体pK7GWIWG2（I）-BrASY2，获得转基因酵母和沉默表达菜心植株，并进行耐热性功能分析。采用花药压片法对BrASY2沉默表达植株细胞减数分裂染色体行为进行细胞学观察。【结果】 BrASY2长度为852 bp，编码283个氨基酸，蛋白相对分子量为69.16 kDa，理论等电点为5.09。基因结构分析表明，其含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲。信号肽预测发现，BrASY2为无信号肽的亲水性蛋白。顺式作用元件分析显示，BrASY2含有9个高温胁迫响应元件CAAT-box。系统进化分析表明，BrASY2与白菜、甘蓝型油菜同源性最高，亲缘关系更近。转录组数据分析表明，在高温胁迫前（0 h），BrASY2在热敏自交系CX7-3和耐热自交系CX1-7中的转录表达水平均较低；在高温胁迫6 h后，BrASY2在CX1-7中的转录表达水平均迅速上升，而在CX7-3中的表达量变化不明显。qRT-PCR结果显示，随着高温胁迫处理时间的延长，耐热自交系CX1-7叶片中BrASY2的表达量呈上调趋势，在处理后24 h时表达量最高，而在热敏自交系CX7-3中始终处于低水平表达状态，表达量无明显变化。经酵母异源超表达分析，超表达酵母菌pYES2-NTB-BrASY2更耐高温，能够帮助酵母菌度过高温逆境。BrASY2沉默表达分析表明，高温胁迫后，与对照植株相比，沉默表达植株的BrHsfA2、BrHsp90和BrMn-SOD的表达均受到抑制，植株叶片颜色变浅，叶绿素含量降低，相对电导率和H₂O₂含量升高，SOD活性下降。减数分裂细胞学观察显示，与对照植株相比，BrASY2沉默植株减数分裂各时期的染色体行为均表现正常，减数分裂后期的均衡分裂细胞和四分体占比，均未表现出明显差异。【结论】 成功获得菜心BrASY2，BrASY2在菜心响应高温胁迫中发挥正向调控作用。