基于模型抗氧化分子互作差异的血液替代品候选氧载体蛋白研究：绵羊与牛血红蛋白的结构与功能比较

本研究针对血红蛋白(Hb)基氧载体(HBOC)在输血应用中易受氧化/亚硝化应激影响的关键问题，通过多光谱技术和分子对接方法，系统比较了戊二醛聚合的牛血红蛋白(poly-bHb)与绵羊血红蛋白(poly-oHb)与抗氧化剂咖啡酸(caffeate)的相互作用差异。研究发现poly-oHb具有更高的氧化稳定性，其与咖啡酸的结合模式显著不同于poly-bHb，这为开发性能更优的血液替代品提供了重要分子依据。

　　

在急救医疗和战伤救治中，输血是抢救严重失血患者的关键手段。然而，血液供应短缺、血型匹配、储存期限和传染病风险等问题长期困扰着临床实践。为此，科学家们致力于开发血红蛋白基氧载体(Hemoglobin-based oxygen carriers, HBOC)作为血液替代品。这类产品需要满足四大核心要求：稳定性、足够大的分子量（防止血管外渗）、适宜的氧亲和力，以及抵抗氧化/亚硝化应激的能力。其中，戊二醛聚合血红蛋白(poly-Hb)因能增加分子量而成为主流技术路线，但聚合过程往往会加剧血红蛋白的氧化损伤，这正是制约HBOC临床应用的关键瓶颈。

传统上，牛血红蛋白(bHb)因其易获得性和对有机变构效应物依赖性低而被视为理想原料。然而近期研究发现，绵羊血红蛋白(oHb)及其聚合产物(poly-oHb)在动物输血实验中表现更优，特别是在抵抗氧化/亚硝化应激方面展现出显著优势。这引发了一个有趣的科学问题：在脊椎动物血红蛋白高度保守的序列背景下，为何不同物种来源的血红蛋白会表现出如此明显的抗氧化差异？为回答这个问题，来自未知机构的研究团队开展了一项系统研究，相关成果发表在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》上。

研究人员采用多学科交叉的研究策略，主要运用荧光光谱（测定结合常数和位点饱和特性）、共振拉曼光谱（监测血红素氧化状态）、核磁共振（分析配体结合构象）、电子顺磁共振（考察蛋白质动态特性）以及分子对接计算（预测结合位点与亲和力）等技术方法，以天然抗氧化剂咖啡酸(caffeate)为分子探针，对bHb与oHb及其聚合产物的相互作用进行了系统表征。

荧光光谱研究揭示了关键差异：oHb在咖啡酸浓度超过25 μM时荧光即达到饱和，表明其荧光响应位点被完全占据，计算得到的结合常数(15.2 μM)优于bHb(24.8 μM)。更值得注意的是，聚合后poly-oHb几乎不再被咖啡酸淬灭，而poly-bHb则保持显著淬灭效应，暗示两种血红蛋白聚合后暴露出不同的芳香氨基酸残基。

共振拉曼光谱结果同样耐人寻味：在442 nm激光激发下，oHb显示出更强的抗自氧化能力（1350 cm^-1
氧合态信号与1375 cm^-1
高铁态信号比值更高）。但聚合过程使oHb的自氧化倾向显著增加，最终使poly-oHb的光谱特征变得与poly-bHb相似。咖啡酸处理会产生类似聚合的效应——增加高铁血红蛋白信号，且这两种效应具有累加性。

核磁共振研究则从另一个维度提供了证据：在500 μM高浓度下，咖啡酸与两种天然Hb的结合模式相似，但与聚合Hb的结合存在明显差异。特别值得注意的是，氰化物加合物的¹
H NMR谱显示咖啡酸结合在血红素边缘，导致邻近质子信号展宽或分裂，这为"抗氧化剂-血红素"相互作用提供了直接证据。相比之下，电子顺磁共振数据显示两种Hb在整体构象动态性上差异不大，但聚合确实显著限制了蛋白质的运动自由度。

分子对接计算最终将这些现象提升到结构生物学层面。研究发现所有三种Hb（牛、绵羊和人）对咖啡酸的结合位点都集中在α/β链界面处，且主要涉及Tyr42、Tyr35、Trp37和Tyr145等芳香氨基酸。特别值得注意的是：oHb中Tyr35在32 μM浓度即参与高亲和力结合，而bHb中对应的Tyr145要到125 μM才参与结合；人类Hb则展现出最高的整体亲和力(16 μM)。另一个关键发现是，血红蛋白的R态（松弛态）比T态（紧张态）对咖啡酸具有显著更高的亲和力，这种构象依赖性差异甚至超过物种间差异。

这项研究从分子水平揭示了poly-oHb性能优势的结构基础：虽然其与咖啡酸的绝对亲和力并非最高，但其芳香氨基酸残基（特别是Tyr35）能以更优化的空间排列参与抗氧化过程。这为设计新一代HBOC提供了重要启示——在关注分子量和氧亲和力等传统参数的同时，应当特别考察化学修饰对血红蛋白抗氧化能力的影响。研究还提出了一个富有启发性的观点：血红蛋白与抗氧化剂的结合具有显著的构象依赖性，这提示我们在评估HBOC性能时需要考虑其在不同生理条件下的动态行为。

从转化医学角度看，该研究不仅确认了oHb作为HBOC原料的潜在优势，更重要的是建立了一套评估血红蛋白抗氧化能力的多参数标准。特别是发现戊二醛聚合会普遍增加血红蛋白的自氧化倾向，这对现有HBOC产品的改进提出了明确警告。未来研究可在此基础上，进一步探索如何通过理性设计保留甚至增强血红蛋白的天然抗氧化特性，从而推动更安全、更有效的血液替代品走向临床。