胡杨GPCR型G蛋白PeuCOLD1调控硝酸盐/钙离子内流增强三倍体毛白杨低温抗性的机制研究

本研究针对杨树低温胁迫耐受性不足的问题，通过克隆胡杨GPCR型G蛋白基因PeuCOLD1，解析其通过促进NO3 - /Ca2+ 内流激活抗氧化系统及COR基因表达，从而增强三倍体毛白杨低温抗性的分子机制。研究为木本植物抗寒育种提供了新靶点，成果发表于《Environmental and Experimental Botany》。

　　

低温胁迫：木本植物的生存挑战与科学应对
杨树作为重要的速生用材树种，其生长常受早春冻害和冬季寒潮威胁。低温会抑制光合作用、引发活性氧(ROS)爆发，导致细胞膜损伤和生长停滞。尽管已知钙信号(Ca²⁺
)和CBF/DREB1通路在拟南芥等草本植物低温响应中起关键作用，但木本植物特有的抗寒机制仍不清楚。尤其令人困惑的是，杨树如何在抵御低温的同时维持快速生长——这一矛盾被学者称为"生长-抗性权衡难题"。

北京林业大学的研究团队通过分析胡杨(Populus euphratica)的胁迫响应基因，发现GPCR型G蛋白家族成员PeuCOLD1在根中高表达且受低温显著诱导。该蛋白与水稻冷受体COLD1同源，具有9次跨膜结构域和保守的亲水环。研究人员将其在三倍体毛白杨(P. tomentosa Carrière)中过表达，结合生理检测、离子流分析和分子实验，系统揭示了其双重功能机制。

关键技术方法
研究采用胡杨幼苗低温处理样本，通过农杆菌介导的叶盘法获得PeuCOLD1过表达株系。利用非损伤微测技术(NMT)检测根尖NO₃
^-
/Ca²⁺
流速，共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位，双通道PAM-100测量叶绿体荧光参数，并采用DAB/NBT染色量化ROS积累。转录组和qPCR分析了CBFs及下游COR基因的表达模式。

分子特征与进化保守性
PeuCOLD1与PtrCOLD1的氨基酸相似度达95%，在根和叶中基础表达量高，-7°C冷冻和4°C低温处理使其表达分别提升8倍和6倍。系统发育分析显示，该蛋白与水稻COLD1^jap
、小麦TaCOLD1-2D共享亲水环结构域，但187位点突变为丝氨酸(S)，暗示木本植物特有的功能演化。跨膜预测和GFP标记实验证实其定位于细胞膜和内质网，这一特性与其感知环境信号的生物学功能相符。

生长调控的离子机制
过表达株系(PeuCOLD1-3/8)表现出显著生长优势：株高增加23%，叶面积扩大18%。NMT检测发现其根尖NO₃
^-
内流速率提高2.1倍，这与硝酸盐转运蛋白基因(NRT2.3/2.5)和钙依赖蛋白激酶(CPK11/13)的上调直接相关。特别值得注意的是，低温触发Ca²⁺
内流峰值达-42 pmol·cm^-2
·s^-1
，较野生型(WT)提高67%，为钙信号激活提供了直接证据。

低温抗性表型解析
4°C处理6天后，WT杨树顶芽萎蔫，而过表达株仅叶片轻微卷曲。叶绿体荧光参数显示，转基因株系的PSII最大光化学效率(Fv/Fm)维持在0.72，显著高于WT的0.51。LI-6400XT测定发现其净光合速率(Pn)降幅较WT减缓41%，表明光合机构受损较轻。这种保护作用与抗氧化系统的强力激活有关：过表达株的SOD、APX活性分别提升2.3倍和1.8倍，H₂
O₂
和MDA含量降低33%-45%。

分子通路调控特征
qPCR揭示PeuCOLD1通过CBF依赖和非依赖双重途径激活抗寒基因：CBF1/2/3转录因子表达量增加4-7倍，下游COR15A、RD29A上调3-5倍。有趣的是，泛素连接酶HOS1的表达被抑制，这可能稳定了核心调控因子ICE1。此外，渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖含量分别增加82%和57%，共同构成细胞保护屏障。

理论突破与应用前景
该研究首次在木本植物中证实GPCR型G蛋白可协同调控生长和抗逆性。PeuCOLD1通过"硝酸盐-钙信号-抗氧化-COR基因"级联反应，破解了杨树生长与抗寒的矛盾。这一发现不仅为分子设计育种提供了新靶点，其诱导的Ca²⁺
快速响应特征更为作物抗逆改良提供了普适性策略。研究团队已利用该基因培育出抗寒性提升且保持速生特性的三倍体毛白杨新品系，对寒地林业发展具有重要实践价值。