VISAGE增强工具在血液与口腔细胞年龄推断中的多实验室验证研究：技术稳健性与模型可靠性评估

本研究针对法医DNA甲基化(DNAm)年龄预测技术缺乏跨实验室验证的问题，由VISAGE联盟主导开展多中心评估。通过6家实验室对血液/口腔拭子样本的系统测试，证实VISAGE增强工具在5 ng低DNA输入量下仍保持稳定甲基化定量能力，血液和口腔样本年龄预测平均绝对误差(MAE)分别为3.95和4.41年。该研究为法医实践提供了标准化技术方案。

　　

在法医学领域，通过生物样本推断个体年龄是识别未知身份者的重要手段。传统方法依赖骨骼形态学特征，但精度有限且不适用于微量检材。近年来，DNA甲基化(DNAm)年龄标记物展现出革命性潜力——特定CpG位点的甲基化水平与年龄呈现高度相关性。目前最先进的检测技术能在3-5年误差范围内预测年龄，但不同实验室采用的检测方法（如焦磷酸测序、微测序或靶向亚硫酸氢盐大规模平行测序(MPS)）存在系统偏差，导致结果难以跨平台比较。更棘手的是，甲基化模式具有组织特异性，且实验流程细微差异（如PCR缓冲液成分、亚硫酸盐转化DNA体积）都可能显著影响最终定量结果。这些技术瓶颈严重阻碍了DNAm年龄预测技术在实战中的应用推广。

针对这一现状，VISAGE联盟（由6所学术和警方实验室组成）开展了迄今为止最全面的跨实验室验证研究。该团队开发的VISAGE增强工具整合了8个经过验证的年龄标记物（KLF14、TRIM59等），通过靶向亚硫酸氢盐MPS技术同步检测，其血液和口腔细胞年龄预测模型在初期测试中分别达到3.2和3.7年的MAE。最新发表在《Forensic Science International: Genetics》的研究，系统评估了该工具在真实实验室环境下的技术稳定性和模型泛化能力。

研究采用两阶段技术路线：第一阶段（5家实验室）使用人工甲基化DNA标准品和4例真实样本进行方法学验证；第二阶段（6家实验室）扩大至160份血液和100份口腔拭子，重点评估年龄预测模型。关键实验技术包括：标准化亚硫酸氢盐转化（使用EZ DNA Methylation-Lightning Kit）、多重PCR扩增（针对8个标记物的24个CpG位点）、Illumina测序平台建库及生物信息学分析（使用VISAGE定制流程）。样本队列包含欧洲多中心采集的临床样本和模拟案件检材。

研究设计
通过分发标准化操作手册严格控制实验变量，所有实验室使用统一试剂盒。技术验证阶段采用梯度稀释DNA（100-5 ng）评估检测灵敏度，并通过甲基化标准品（0%、50%、100%甲基化水平）验证定量准确性。

结果与讨论
技术性能方面，所有实验室在5 ng DNA输入量下仍保持稳定检测能力，不同批次间甲基化定量变异系数<10%。年龄预测模型测试显示，血液样本整体MAE为3.95年（较初期测试上升0.7年），其中1家实验室出现系统性低估现象（MAE达5.2年）。排除该异常数据后，血液MAE降至3.1年（N=89），提示实验室特定因素可能影响模型性能。口腔拭子结果则表现出良好的一致性（MAE=4.41±0.3年），无显著实验室间差异。

结论
该研究首次证实VISAGE增强工具在跨实验室应用中保持稳定的甲基化检测性能，其年龄预测模型对口腔细胞具有更强鲁棒性。值得注意的是，即使采用标准化流程，个别实验室仍可能出现系统偏差，强调本地化验证的必要性。这些发现为法医DNAm检测的标准化实践提供了重要基准，推动该技术从研究向实战转化。

意义
作为目前规模最大的法医表观遗传学多中心研究，该成果不仅验证了MPS技术在年龄推断中的优势，更建立了可推广的质量控制框架。特别是证实5 ng微量DNA（相当于1μL血液）仍可获可靠结果，极大拓展了技术在陈旧检材、微量物证等实战场景的应用前景。研究团队建议各实验室在引入该工具时，需通过内部验证调整模型参数以优化预测精度。