新型苯甲醛裂解酶与羰基还原酶协同催化一锅法不对称合成手性邻二醇及其药物应用

本研究针对手性邻二醇合成中立体选择性控制难、底物范围窄等问题，开发了高通量自动口袋体积与溶解度筛选(HAPVSS)策略，成功挖掘出能催化邻位取代芳香醛的新型苯甲醛裂解酶(BALs)，并改造羰基还原酶KlCR2实现α-羟基酮的不对称还原。通过多酶级联反应高效合成了28种高纯度立体异构体(dr达99:1，er>99:1)，为抗阿尔茨海默病药物JBPOS0101等关键中间体提供了绿色合成路径。

　　

手性邻二醇是抗病毒药物奥司他韦和阿尔茨海默病候选药物JBPOS0101的关键结构单元，但其合成长期面临相邻手性中心立体控制难、化学法污染大等挑战。传统生物催化虽具环保优势，但单酶体系存在底物范围窄、产物构型单一等局限。针对这一难题，研究人员开发了创新的HAPVSS酶挖掘策略，通过整合序列相似性网络、AlphaFold结构预测和口袋体积计算，突破了苯甲醛裂解酶对邻位取代芳香醛的催化瓶颈。

研究团队首先构建了包含3620个BAL同源酶的数据库，利用Alphafold 2&3预测蛋白二聚体结构并计算活性口袋体积（如DoBAL口袋达1678 ?³
），结合溶解度预测筛选出DoBAL等新型酶。令人惊讶的是，这些酶催化邻氯苯甲醛(o-ClBA)时生成(S)-2-羟基苯乙酮(2-HPP)，与经典BALs的(R)-构型偏好相反。通过分子对接发现，DoBAL的S482残基与小口袋体积(47.1 ?³
)共同决定了这种"构型反转"现象。

在羰基还原酶改造方面，研究者鉴定了来自乳酸克鲁维酵母的KlCR2，通过迭代饱和突变获得KlCR2_M_R3
(Y106H/H181F/S148C)和KlCR2_M_S4
(Y106F/G257F/Y217C/S148F)突变体。前者使(R,S)-二醇比例提升至98:2，后者则实现(S,S)-二醇99%选择性，活性分别提高4.2倍和2.8倍。分子动力学模拟显示，突变体通过重塑口袋几何形状（KlCR2_M_S4
口袋体积达660.3 ?³
）控制底物结合取向。

关键技术包括：1) HAPVSS策略整合序列网络分析与结构生物信息学；2) Alphafold 2&3蛋白结构预测与fpocket口袋计算；3) 定向进化改造KlCR2活性位点；4) 钼诱导圆二色谱(ECD)绝对构型鉴定；5) 500 mL规模一锅两步酶催化。

研究结果部分：

1. HAPVSS策略开发与新型BALs发现
   通过SSN分析将BAL家族划分为不同进化分支，结构预测发现DoBAL等大口袋酶(>1000 ?³
   )能耐受o-ClBA的空间位阻。实验验证75%筛选成功率，DoBAL催化o-ClBA转化率达72%，er(S:R)=96:4。

2. BALs立体选择性机制解析
   突变研究表明，PfBAL的A28G/T497N组合使2-HPP产率提升8倍，而DoBAL的S482D突变实现构型反转但活性降低。这揭示了甘氨酸残基(G32)通过稳定水分子网络增强乙醛亲和力的新机制。

3. KlCR2工程化改造
   Y106位点扮演"守门员"角色：极性组氨酸突变促使底物进入C1口袋生成(R,S)-产物，而苯丙氨酸突变则引导底物进入C2口袋形成(S,S)-产物。NADPH的C4H与羰基距离(2.8 ? vs 2.9 ?)解释了活性差异。

4. 一锅法合成四种立体异构体
   以o-ClBA为模型底物，PpBFD_M1催化第一步反应(er>99:1)，结合KlCR2突变体实现四种构型二醇合成：(1S,2S)-构型(3a)作为JBPOS0101前体，总收率78%，dr 98:2。

5. 底物范围拓展
   体系成功应用于28种邻二醇合成，包括单环(4b-g)、稠环(4n-q)和杂环(4u-v)衍生物。其中苯丙醛衍生的γ,δ-二醇(4j)和杂环底物4u(dr 70:30)展示了体系多样性。

结论与意义：
该研究通过创新HAPVSS策略，首次实现了BALs对邻位取代芳香醛的高效催化，打破了该家族固有的(R)-构型限制。通过理性设计KlCR2的"立方型"(504.1 ?³
)和"矩形"(660.3 ?³
)活性口袋，建立了从同一前体获取四种立体异构体的普适方法。工作不仅为JBPOS0101等药物中间体提供了年产吨级的绿色合成方案（克级规模dr>99:1），更开创了将结构特征纳入酶挖掘标准的新范式。HAPVSS策略的通用性有望拓展至其他酶家族，为复杂手性分子的精准合成提供新思路。论文发表于《Green Synthesis and Catalysis》，展示了生物催化在药物绿色制造中的巨大潜力。