融合蛋白标签策略优化重组表达新设计微型蛋白LCB1与AHB2的生产工艺研究

本研究针对微型蛋白(4-12 kDa)重组表达产量低、纯化损耗大的技术瓶颈，系统评估了SUMO、Trx、GFP、PhoN及StrepII-6xHis五种融合标签对两种靶向病毒刺突蛋白的微型蛋白(LCB1和AHB2)在E. coli中表达效率的影响。结果表明SUMO标签使产量最高达3.3毫摩尔/升，并通过SPR和MD模拟揭示了N端残留氨基酸对结合活性的影响，为微型蛋白药物的规模化生产提供了关键技术方案。

　　

在生物医药领域，微型蛋白（miniprotein）因其介于小分子药物和抗体之间的独特优势，正成为治疗性药物的新宠。这类4-12 kDa的工程化蛋白不仅能像抗体一样精准识别靶点，还具备更好的组织穿透性和稳定性。然而，一个长期困扰研究人员的难题是：如何在微生物系统中高效生产这些结构精巧的"分子导弹"？传统方法往往面临表达量低、易降解、纯化回收率差等挑战，严重制约了其临床应用转化。

针对这一关键技术瓶颈，来自印度HBNI-RRCAT的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表了一项创新研究。他们选取了两个具有代表性的微型蛋白——靶向新冠病毒刺突蛋白的LCB1（6.8 kDa）和AHB2（9.1 kDa）作为模型，系统比较了五种融合蛋白标签对其在大肠杆菌中表达和纯化效率的影响。这两种微型蛋白此前已被证实能以纳摩尔至皮摩尔级亲和力阻断病毒与ACE2受体的结合，展现出优异的治疗潜力，但其规模化生产方案尚未明确。

研究人员采用了多组学联动的技术路线：通过分子克隆构建含不同标签（SUMO、硫氧还蛋白Trx、超折叠绿色荧光蛋白sfGFP、酸性磷酸酶PhoN及StrepII-六组氨酸标签）的重组质粒；利用温度梯度（18-37°C）和IPTG浓度优化表达条件；采用镍柱亲和层析（Ni-IMAC）进行捕获纯化；最后通过TEV蛋白酶和SUMO蛋白酶特异性切割获得目标微型蛋白。特别运用表面等离子共振（SPR）和分子动力学（MD）模拟评估了酶切残留的N端延伸序列（如g-s、g-g-s）对蛋白结合功能的影响。

【Plasmid construction for fusion protein】
研究团队以pST50Tr质粒为骨架，在StrepII-6xHis标签下游插入各融合标签基因，并引入TEV蛋白酶识别位点。测序验证显示所有构建体均保持正确的阅读框和蛋白酶切割位点，为后续表达研究奠定基础。

【Expression studies at various temperature and IPTG concentration】
温度筛选实验揭示18°C培养能显著提高可溶性蛋白产量，而IPTG浓度（0.2-1 mM）对多数融合蛋白表达量影响不显著。PhoN标签因自带磷酸酶活性，可通过显色反应直观监测表达水平，为工艺开发提供便利。

【结论与意义】
该研究首次系统证实SUMO标签能使LCB1表达量提升至3.3毫摩尔/升培养液，各标签表达效率排序为：SUMO > GFP > Trx > StrepII-6xHis > PhoN。融合策略不仅解决了微型蛋白因分子量过小导致的纯化损失问题（避免使用特殊电泳技术），还通过增加分子体积有效防止了蛋白酶降解。虽然酶切残留的2-3个N端氨基酸经证实会轻微影响结合动力学，但MD模拟显示这种效应可通过后续工程化优化。

这项研究为加速微型蛋白药物的产业化提供了关键技术路线：优选SUMO/GFP标签结合低温表达的策略，可大幅提高产量并降低生产成本；建立的标准化评估体系（SPR结合MD模拟）为类似产品的质量评价提供了新范式。尤其值得注意的是，该方案完全基于大肠杆菌表达系统，使得生产成本仅为哺乳动物细胞系统的1/10，对推动平价生物药的开发具有重要经济价值。未来通过优化切割酶体系和N端序列设计，有望进一步消除工艺相关变异体对药效的影响。