电荷工程改造蛋白谷氨酰胺酶FBPG在毕赤酵母中的高效活性表达及工业应用研究

本研究针对海洋来源蛋白谷氨酰胺酶FBPG催化活性低、缺乏高效表达系统等问题，通过活性位点电荷改造（A223H/R225K突变体提升比活性9.43倍）、毕赤酵母表达系统优化（采用PDH 启动子）及Kex2酶切位点设计，实现无需酶切的活性FBPG高效分泌表达（7 L发酵罐产量达2610 U/L），为食品工业蛋白修饰提供新策略。

　　

蛋白谷氨酰胺酶（Protein glutaminase, PG）作为能特异性水解蛋白质侧链谷氨酰胺基团的功能酶，在改善植物蛋白功能特性（如溶解性、乳化性）方面具有重要应用价值。然而现有PG类酶（如CPPG）存在催化效率低、依赖野生菌发酵产量不足等瓶颈。更棘手的是，这类酶通常以无活性的前酶形式存在，需额外蛋白酶切除前肽才能激活，大幅增加工业成本。来自中国的研究团队聚焦海洋细菌来源的新型PG——FBPG，其虽在酸性高温条件下展现优势，但比活性仅为CPPG的1/9.43，且同样面临前肽处理的难题。

为解决这一系列问题，华南理工大学等机构的研究人员在《International Journal of Biological Macromolecules》发表研究，通过多维度工程技术改造实现FBPG的突破性升级。研究首先采用计算机辅助设计对活性口袋附近氨基酸进行电荷工程改造，筛选出关键突变体；随后构建毕赤酵母表达系统，创新性地引入内源性Kex2蛋白酶切割位点实现前肽自切除；最终通过转录因子调控和发酵工艺优化，建立无需后处理的活性FBPG规模化生产体系。

关键技术方法包括：1) 基于静电势分析的定点突变技术；2) 毕赤酵母多启动子（P_AOX1

、P_GAP

、P_DH

）筛选；3) Kex2识别序列（KRNAEA）的P1'位点优化；4) 转录因子（Sko1等）过表达策略；5) 7 L规模发酵工艺。

【研究结果】
• 活性位点电荷改造：通过对比FBPG与CPPG的静电势分布，发现A223H/R225K双突变使活性口袋正电荷增强，比活性提升至15.18 U/mg（野生型1.61 U/mg），且热稳定性显著改善。

• 表达系统优化：在毕赤酵母中测试三种启动子，发现P_DH

驱动表达时胞外蛋白浓度最高（0.82 mg/mL），较常用P_AOX1

提高2.3倍。

• 前肽自切割设计：将Kex2识别序列插入前肽与成熟肽连接处时，发现P1'位点选择天冬酰胺（Asn）比传统碱性氨基酸（Lys/Arg）更高效，使活性酶比例从35%提升至92%。

• 产量强化：过表达应激响应转录因子Sko1使产量提升60%，7 L发酵罐最终产量达2610 U/L，较初始水平提高11.7倍。

该研究通过"电荷优化-表达强化-自激活设计"三级策略，首次实现FBPG的高效活性表达。突变体A223H/R225K的催化效率接近商业化CPPG水平，而毕赤酵母分泌表达系统避免了传统酶切纯化步骤，大幅降低生产成本。特别值得注意的是，Kex2切割位点的创新设计为其他前肽依赖性酶的表达提供普适性方案，而Sko1过表达揭示转录调控在异源蛋白生产中的关键作用。这些突破不仅推动PG类酶在食品工业（如小麦蛋白、燕麦蛋白改性）中的应用，也为复杂酶制剂的工业化生产树立新范式。