人类甲硫氨酸合成酶P1173L变异体损害还原甲基化导致高胱氨酸尿症的分子机制研究

本研究针对高胱氨酸尿症相关P1173L变异体导致人类甲硫氨酸合成酶(MTR)功能缺陷的机制展开研究。通过共表达B12 伴侣蛋白MMADHC成功实现全长MTR可溶性表达，发现该变异体在生理性MTRR/NADPH还原系统中活性降低30倍，且AdoMet的KM 值升高40倍。预稳态动力学分析揭示该突变导致电子传递速率显著下降，为开发新型治疗策略提供理论依据。

　　

维生素B₁₂
（钴胺素）是人体必需的辅因子，参与甲硫氨酸合成和甲基丙二酸代谢两条关键通路。其中，甲硫氨酸合成酶(MTR)作为依赖甲基钴胺素(MeCbl)的酶，催化同型半胱氨酸(HCy)甲基化生成甲硫氨酸，同时将5-甲基四氢叶酸(CH₃
-H₄
F)转化为四氢叶酸(H₄
F)。然而MTR在催化过程中易被氧化失活，需要甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)通过NADPH/AdoMet依赖的还原甲基化反应修复。临床上，MTR基因突变会导致高胱氨酸尿症，表现为血液同型半胱氨酸水平升高和侵袭性心血管疾病。其中P1173L突变占患者群体的70%，但长期以来由于全长人MTR重组表达困难，其分子机制一直未被阐明。

为解决这一难题，密歇根大学的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表重要成果。研究人员创新性地通过共表达B₁₂
伴侣蛋白MMADHC，首次实现全长人MTR的可溶性表达。研究发现P1173L变异体在人工还原系统(DTT/B₁₂
)中虽保持正常活性，但在生理性MTRR/NADPH系统中活性骤降30倍。通过整合稳态/预稳态动力学、EPR光谱和蛋白质柔性分析等技术，揭示该突变通过改变AdoMet结构域构象，使电子传递步骤成为限速环节，为理解该常见突变的致病机制提供了分子基础。

关键技术包括：1）MMADHC共表达系统实现全长MTR可溶性生产；2）稳态酶动力学分析比较野生型与突变体参数差异；3）停流光谱技术追踪纳秒级电子传递过程；4）EPR光谱解析钴胺素配位环境变化；5）DynaMut预测蛋白质柔性改变。

【研究结果】

1. 全长人MTR的纯化：通过共表达MMADHC获得高纯度MTR（3 mg/L），验证其正确折叠并能结合MeCbl。

2. 野生型MTR的稳态动力学表征：测得比活度2.5 μmol/min/mg（MTRR/NADPH系统），K_M
   值分别为：L-同型半胱氨酸3 μM、(6S)-CH₃
   -H₄
   F 108 μM、AdoMet 0.19 μM。

3. CH₃
   -H₄
   F促进辅因子加载：HPLC证实AdoMet是B₁₂
   加载过程中的甲基供体，而CH₃
   -H₄
   F可增强该反应效率。

4. P1173L突变损害MTR再激活：Native-PAGE显示突变体与MTRR复合物稳定性异常，生理系统中比活度降至0.08 μmol/min/mg，AdoMet的K_M
   升至8 μM。

5. 预稳态动力学分析：突变使电子传递速率从>27.5 s^-1
   降至0.007 s^-1
   ，并延缓5-c→6-c MeCbl转化（2.8→1.4 s^-1
   ）。

6. EPR谱学特征：突变轻微改变钴(II)胺素的His/H₂
   O配位平衡（71%→59%氮配位），但MTRR仍能诱导配体转换。

7. 蛋白柔性预测：P1173L突变增强局部疏水相互作用（3.2-3.3 ?），降低AdoMet结构域与MTRR界面柔性。

【结论与意义】
该研究首次阐明P1173L突变通过三重机制导致MTR功能障碍：①损害MTRR→cob(II)alamin电子传递（限速步骤）；②降低AdoMet结合亲和力；③延缓催化构象转换。AlphaFold2模型显示Pro-1173位于AdoMet结合环，其突变导致相邻残基（Leu-1082、Ile-1771等）形成更强疏水网络，限制蛋白柔性进而影响电子传递效率。

临床转化方面，发现二氢硫辛酸(DHLA)/B₁₂
可部分恢复突变体活性，为开发绕过MTRR缺陷的小分子治疗方案提供新思路。该成果不仅破解了高胱氨酸尿症最常见突变的分子病理，建立的研究范式也为其他B₁₂
代谢障碍研究提供重要参考。