RNA聚合酶II-CTD的Ser7磷酸化调控E3泛素连接酶Asr1招募及端粒邻近基因沉默的分子机制

本研究揭示了RNA聚合酶II羧基端结构域(CTD)的Ser7磷酸化(Ser7P)对E3泛素连接酶Asr1招募的关键作用。通过酵母双杂交、染色质免疫沉淀(ChIP)和分子动力学模拟等技术，研究人员发现Asr1通过特异性识别CTD上"Ser7P-第一重复序列/Ser5P-第三重复序列"的独特磷酸化模式，利用关键残基Lys43/Arg48/Arg168/Arg252实现结合，并鉴定Ubc2为其特异性E2泛素结合酶。该发现阐明了Ser7P在端粒邻近基因沉默中的新机制，为转录延伸调控提供了新见解。

　　

在真核生物基因表达调控的精密交响曲中，RNA聚合酶II（RNAPII）的羧基端结构域(CTD)犹如一位多才多艺的指挥家，通过其重复序列Y₁
S₂
P₃
T₄
S₅
P₆
S₇
的动态磷酸化，协调转录机器的各个"声部"。尽管Ser5和Ser2磷酸化的功能已被深入解析，但Ser7磷酸化(Ser7P)在蛋白编码基因中的角色始终笼罩着神秘面纱——这个在转录全周期持续存在的修饰标记，既不能简单地被磷酸模拟物谷氨酸替代，又与高转录活性基因显著相关，暗示着其不可替代的生物学功能。

与此同时，泛素-蛋白酶体系统作为细胞最重要的"质检员"之一，通过E3泛素连接酶Asr1对RNAPII进行非降解型泛素化修饰，在端粒邻近基因沉默中扮演关键角色。然而，这个调控过程的精确"触发开关"尚未明确。中央药物研究所的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的研究，如同解开了一道分子级别的密码锁，揭示了Ser7P作为Asr1招募的关键信号，及其在空间特异性基因沉默中的核心作用。

研究人员运用了酵母双杂交系统筛选CTD磷酸化依赖性互作、体外泛素化实验验证酶活调控、RNA测序分析全局转录变化、染色质免疫沉淀(ChIP)定位蛋白基因组分布、以及AlphaFold2结构预测结合分子动力学模拟等关键技术，构建了从分子互作到生理功能的完整证据链。

Ser7P是Asr1招募和端粒邻近基因沉默的关键
通过创新的磷酸化敏感性酵母双杂交系统，研究发现Asr1与野生型CTD及Ser2突变体正常互作，但与Ser5/Ser7单突变或双突变体结合显著减弱。体外泛素化实验显示，Ser7突变导致GST-CTD的泛素化效率降低。RNA测序更揭示Ser7突变导致端粒60kb内大量基因异常激活，ChIP-qPCR证实这些位点的Asr1招募显著减少，而RNAPII核心亚基Rpb3的分布不受影响，证明Ser7P特异性调控Asr1的基因组定位。

Asr1结构与CTD互作模式解析
借助AlphaFold2预测的Asr1三维结构显示其具有RING、PHD和CTD结合域(CBD)的模块化架构。通过蛋白质-肽段对接和500ns分子动力学模拟，发现Asr1以独特"双位点识别"模式结合CTD：第一重复序列的Ser7P与Lys43/Arg48/Cys124形成稳定接触，而第三重复序列的Ser5P则与Arg168/Arg252相互作用。关键残基突变实验证实，这些接触对Asr1的CTD结合和基因沉默功能不可或缺。

Ubc2作为Asr1的专属E2酶
泛素化级联反应实验突破性地鉴定出Ubc2（而非Ubc13）是Asr1的特异性E2泛素结合酶。浓度梯度实验显示Ubc2剂量依赖性地增强Asr1的自身泛素化和CTD泛素化活性，为端粒沉默的酶学机制补全了最后一块拼图。

这项研究首次建立了"CTD密码-Asr1招募-基因沉默"的分子通路：RNAPII在转录延伸过程中形成的Ser7P-Ser5P间隔磷酸化模式，如同特制的"分子钥匙"，通过Asr1的Lys43/Arg48/Arg168/Arg252等"锁齿"实现精准识别，进而招募Ubc2介导的泛素化系统实施空间特异性转录调控。该发现不仅解释了高转录活性基因为何富含Ser7P标记，更为理解表观遗传沉默在端粒维持、应激响应等生理过程中的调控提供了新视角。在技术层面，创新的"计算模拟-生化验证"研究范式，为解析其他CTD结合蛋白的识别机制树立了典范。未来针对Ser7P调控网络的深入研究，可能为端粒相关疾病和转录失调病症带来新的干预策略。