Myrothecium verrucaria来源胆红素氧化酶的热稳定性设计与工业应用潜力

本研究针对胆红素氧化酶（BOD）在高温环境下易失活的问题，通过蛋白质工程策略（脯氨酸取代、盐桥设计和疏水相互作用优化）成功构建了热稳定性突变体。关键突变L476P/A496P（主链稳定）、Q495R（盐桥）和A264V（疏水作用）使突变体在60°C处理1小时后残留活性较野生型（WT）提高3.9倍，最适温度提升近10°C，且不影响其2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）氧化活性，为多价铜氧化酶的工业应用提供了新思路。

　　

胆红素氧化酶（Bilirubin oxidase, BOD）作为多价铜氧化酶家族成员，在生物体内催化胆红素转化为胆绿素的过程中扮演关键角色。然而，天然BOD的热稳定性不足严重限制了其在工业环境（如生物传感器、废水处理等高温场景）中的应用。来自Myrothecium verrucaria的BOD虽具有高效催化能力，但其在60°C以上迅速失活的特性成为技术瓶颈。

为解决这一难题，研究人员通过整合三种蛋白质工程策略：主链稳定化（脯氨酸取代）、盐桥网络设计和疏水相互作用优化，成功构建了高耐热BOD突变体。研究以野生型BOD（PDB 6IQZ）为模板，利用AlphaFold2预测突变体三维结构，结合PyMOL进行可视化分析。关键突变L476P和A496P通过限制主链构象自由度增强刚性；Q495R引入新的盐桥稳定局部结构；A264V则强化了核心疏水堆积。

结构解析与优化
通过AlphaFold2建模和PyMOL结构比对证实，突变体维持了BOD典型的β-桶状核心结构，而突变位点均位于对热敏感的区域。脯氨酸取代使Loop区构象熵降低，盐桥与疏水作用的协同效应显著提升了整体结构的耐热性。

脯氨酸取代效应
L476P和A496P突变通过将柔性氨基酸替换为构象受限的脯氨酸，使蛋白主链在高温下仍保持稳定。实验显示这两个突变单独作用时即可使酶在60°C下的半衰期延长2倍。

综合性能验证
组合突变体表现出突破性性能：60°C处理1小时后残留活性达野生型的3.9倍，最适反应温度从55°C提升至65°C。值得注意的是，所有突变均未影响其对经典底物ABTS的催化效率，表明热稳定性提升未牺牲酶的本征活性。

该研究首次系统验证了多策略协同优化对BOD热稳定性的倍增效应，为其他工业酶改造提供了范式。突变体在生物燃料制备（需高温脱除色素）和医疗检测（需长期储存稳定性）等领域具有明确应用前景。论文发表于《Journal of Bioscience and Bioengineering》，通讯作者Kazuhiko Ishikawa强调，这种"结构-功能双轨优化"策略可扩展至整个多价铜氧化酶家族。