荧光假单胞菌中可溶性重组人胰岛素生产的细胞工程策略及分批生物反应器研究

本研究针对重组人胰岛素生产中包涵体形成的关键难题，通过系统优化荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）表达体系，探究了分子伴侣（DsbA、Pbp）与信号肽的协同作用、His-tag定位及质粒拷贝数对可溶性蛋白产量的影响。研究实现了234.58 mg/l融合蛋白产量（71.59%可溶），并通过圆二色谱（CD）验证其结构与标准胰岛素一致，为糖尿病治疗提供了高性价比的生产方案。

　　

糖尿病作为全球十大死因之一，其治疗核心——重组人胰岛素的生产却长期面临包涵体形成、可溶性低等技术瓶颈。传统表达系统因成本高、工艺复杂难以满足日益增长的临床需求，而荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）因其高蛋白表达量、不积累乙酸等优势成为潜在替代宿主。然而，该菌蛋白酶易降解小分子量胰岛素，且低温培养虽提高可溶性却牺牲产量。如何平衡产量与可溶性，成为突破产业困境的关键。

印度理工学院的研究团队通过多维度工程改造，首次在荧光假单胞菌中实现高产量可溶性人胰岛素生产。研究采用质粒工程（优化复制起始位点ori和抗生素抗性基因）、分子伴侣（DsbA/Pbp）共表达、信号肽筛选及His-tag定位策略，结合分批生物反应器工艺优化，系统提升目标蛋白的折叠效率与分泌能力。关键技术包括：质粒构建（spectinomycin抗性筛选）、圆二色谱（CD）结构验证、OD₆₀₀
/IPTG诱导条件优化等。

主要研究结果

1. 分子伴侣与信号肽协同效应
   DsbA（二硫键异构酶）与Pbp（磷酸结合蛋白）组合使融合蛋白可溶性提升至60%，证实分子伴侣网络对胰岛素正确折叠的促进作用。

2. His-tag定位影响
   N端His-tag设计在保持蛋白活性的同时，显著提高Ni-NTA纯化效率，避免C端标签导致的构象干扰。

3. 质粒拷贝数调控
   低拷贝ori质粒减少代谢压力，缩短滞后相，使可溶性蛋白产量较髙拷贝质粒提升27%。

4. 生物反应器工艺优化
   通过调控接种量（5%）、诱导OD₆₀₀
   （8.0）和IPTG浓度（0.5 mM），最终获得234.58 mg/l融合蛋白，其中71.59%为可溶形式，且15%分泌至上清液。

结论与意义
该研究首次阐明荧光假单胞菌中分子伴侣-信号肽协同作用机制，建立了一套高效可放大的胰岛素生产体系。其创新性体现在：① 通过DsbA/Pbp组合解决二硫键形成难题；② 工艺优化实现产量（58%）与可溶性（27%）同步提升；③ CD光谱证实产物结构与商业胰岛素一致。这一成果为糖尿病药物降本增效提供了新思路，尤其对口服胰岛素开发具有重要产业价值。论文发表于《Journal of Biotechnology》，为原核系统表达复杂真核蛋白提供了范式参考。