酮病奶牛肝细胞坏死性凋亡与肝损伤的关联机制及治疗靶点研究

针对酮病奶牛肝损伤机制不明的问题，吉林大学团队通过临床样本和体外实验，首次揭示TNF-α通过激活RIPK1/RIPK3-MLKL通路诱导肝细胞坏死性凋亡（necroptosis），导致ALT/AST升高和炎症因子释放。使用Nec-1和GSK-872抑制剂可显著缓解损伤，为改善奶牛代谢性疾病提供了新靶点。

　　

在奶牛养殖业中，酮病（ketosis）是围产期高发代谢性疾病，约15-30%的高产奶牛因此出现产奶量下降和肝功能异常。这种疾病的核心矛盾在于：奶牛分娩后能量需求激增，但采食量不足导致脂肪过度动员，肝脏在代谢超负荷状态下发生损伤。传统研究多聚焦于脂毒性或氧化应激机制，然而近年发现，一种被称为坏死性凋亡（necroptosis）的程序性细胞死亡形式，在人类非酒精性脂肪肝等疾病中扮演关键角色。这种死亡方式会释放损伤相关分子模式（DAMP），引发"炎症风暴"。但令人惊讶的是，关于坏死性凋亡是否参与酮病奶牛肝损伤，此前竟完全未有研究。

针对这一空白，吉林大学的研究团队开展了一项从临床到机制的系统研究。他们首先采集了15头酮病奶牛和15头健康奶牛的血液与肝组织样本，通过检测血清ALT、AST、GGT和GLDH等肝酶活性确认肝损伤程度，结合H&E染色观察组织病理变化。随后采用Western blot、qRT-PCR和免疫组化分析坏死性凋亡关键蛋白RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平。为验证TNF-α的诱导作用，团队分离1日龄犊牛原代肝细胞，用10 ng/mL TNF-α刺激并联合抑制剂Nec-1（靶向RIPK1）或GSK-872（靶向RIPK3）处理，通过PI染色、酶活性检测和炎症因子mRNA表达评估干预效果。

肝损伤与炎症的临床证据
酮病奶牛血清中ALT、AST、GGT和GLDH活性较健康组显著升高2-3倍，肝组织出现特征性胞质空泡化、溶解性坏死和炎性细胞浸润。促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA表达量同步增加，免疫荧光显示CD11b⁺
单核/巨噬细胞浸润增强，证实酮病伴随肝损伤和局部炎症微环境。

坏死性凋亡通路的激活
Western blot显示酮病奶牛肝组织中p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3和p-MLKL/MLKL比值显著升高，mRNA水平上RIPK1、RIPK3和MLKL表达增加2倍以上。免疫组化进一步定位p-MLKL和p-RIPK3在病变肝细胞的富集，首次在分子层面证实坏死性凋亡通路激活与酮病肝损伤的关联。

TNF-α的机制验证
体外实验显示，10 ng/mL TNF-α处理使原代肝细胞PI阳性率从5%飙升至35%，伴随RIPK1/RIPK3-MLKL通路磷酸化级联反应。值得注意的是，当联合使用zVAD.fmk抑制凋亡时，坏死性凋亡标志物表达进一步增强，说明TNF-α在该模型中优先激活坏死性凋亡而非凋亡途径。

靶向干预的治疗潜力
100 μM Nec-1或3 μM GSK-872预处理可分别降低TNF-α诱导的PI阳性细胞比例至12%和15%，同时使ALT/AST活性下降40-50%。机制上，Nec-1同时抑制RIPK1/RIPK3/MLKL三级磷酸化，而GSK-872选择性阻断RIPK3-MLKL轴。两种干预均能显著下调IL-1β和IL-6表达，证实阻断坏死性凋亡可打破"细胞死亡-炎症"恶性循环。

这项发表在《Journal of Dairy Science》的研究具有双重意义：在理论层面，首次建立酮病肝损伤与坏死性凋亡的因果关系，补充了"代谢紊乱-炎症-细胞死亡"的病理链条；在应用层面，提出RIPK1/RIPK3抑制剂作为潜在治疗策略，为改善围产期奶牛健康提供新思路。值得注意的是，研究采用犊牛肝细胞虽存在发育差异，但前期实验证实其保留成熟肝细胞的关键功能。未来研究需在酮病奶牛模型中验证抑制剂疗效，并评估长期应用对免疫功能的潜在影响。这项成果不仅对兽医临床有指导价值，也为人类代谢性疾病研究提供了跨物种参考。