毕赤酵母中3C蛋白酶非依赖型口蹄疫病毒样颗粒的高效制备及其免疫原性研究

这篇研究创新性地利用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统，通过直接共表达VP0/VP3/VP1结构蛋白（无需3C蛋白酶切割），成功组装出口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLPs)。研究揭示了蛋白表达盒顺序对组装效率的影响，发现VP0表达量最高；通过结构分析将His6 标签插入VP1的G-H环区或C端、VP3的C端不影响VLPs组装，为工业化纯化提供了新策略。该成果规避了3C蛋白酶的毒性问题，为安全高效的FMD亚单位疫苗开发奠定基础。

　　

3C蛋白酶非依赖型口蹄疫病毒样颗粒的毕赤酵母制备

Abstract
口蹄疫(FMD)灭活疫苗虽广泛应用但仍存安全隐患。研究采用毕赤酵母——这一生产成本最低的真核表达系统，通过直接共表达VP0、VP3、VP1结构蛋白（绕开3C蛋白酶对P1前体的切割步骤），成功实现FMDV VLPs的组装。Western blot显示同一质粒上各蛋白表达量存在差异：VP0最高，VP3与VP1相近。通过调整质粒上基因表达盒顺序可优化蛋白表达平衡。三维结构分析表明，VP3和VP1的N端位于VLPs外部空间，可融合His₆
标签；在VP1的G-H环区插入His₆
标签不影响组装，为亲和纯化提供了新思路。

Introduction
FMDV属于小RNA病毒科，其衣壳由60拷贝的VP1-VP4蛋白构成。传统VLPs生产依赖3C蛋白酶切割P1前体，但该酶存在非特异性切割宿主蛋白的毒性问题。毕赤酵母系统虽已用于乙肝疫苗等生产，但此前未见FMDV VLPs报道。本研究突破性地采用3C非依赖策略，通过结构指导的标签插入，解决了蛋白酶毒性、切割效率与纯化难题。

Materials and methods
实验采用PichiaPink? Strain 1菌株，在pPink-HC质粒中构建VP0(H2145Y突变)、VP3、VP1(N1017D突变)及其His₆
标签变体的共表达载体。通过蔗糖梯度离心和镍柱亲和层析纯化VLPs，动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)验证组装，ELISA定量颗粒浓度。

Results

1. 蛋白表达优化：天然顺序（VP0-VP3-VP1）表达时VP0占比达60%，调整顺序后表达更均衡。
2. 培养条件：pH 7诱导72小时时蛋白产量最高，pH 8导致细胞死亡。
3. 标签定位：His₆
   插入VP1-GH环或VP1/VP3 C端时，电镜显示完整30 nm颗粒，而N端标签导致大量五聚体堆积。
4. 纯化效率：3CH（VP3-C端标签）的VLPs得率与常规纯化相当，1CH（VP1-C端标签）下降50%。

Discussion
该研究首次在毕赤酵母中实现FMDV VLPs的3C非依赖生产：
• 突破性发现表达盒顺序可调控亚基比例，VP0天然高表达特性可能与酵母翻译机制相关
• 结构指导的标签插入策略：G-H环作为抗原表位区，其修饰不影响组装，为多价疫苗设计提供可能
• 酸稳定性突变体（N1017D/H2145Y）耐受pH 7培养环境，解决了传统FMDV颗粒的pH敏感性难题
相比哺乳动物细胞系统，该方法成本降低80%，且规避了生物安全风险，为发展中国家FMD防控提供了可规模化生产的疫苗候选平台。