基于PCV2 Cap蛋白自组装病毒样颗粒的双价纳米疫苗设计及其对PRRSV和PCV2感染的协同保护作用

本研究针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)共感染难题，创新性地利用PCV2 Cap蛋白自组装病毒样颗粒(VLPs)为载体，嵌合PRRSV中和表位(GP5B/GP3I/GP5IV)，成功开发出Cap-DS纳米疫苗。该疫苗在小鼠和仔猪模型中均诱导高水平中和抗体，显著降低攻毒后病毒载量，为双价疫苗研发提供新策略。

　　

在现代化养猪业中，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)就像一对"恶魔搭档"——PRRSV导致母猪流产、仔猪呼吸困难，PCV2引发多系统衰竭综合征。更棘手的是，这两种病毒经常协同作案：PCV2会削弱猪的免疫系统，为PRRSV大开方便之门，形成恶性循环。传统单苗效果有限，PRRSV灭活疫苗保护力不足，弱毒苗又有毒力返祖风险；PCV2疫苗虽有效，却对PRRSV束手无策。面对这个养殖业的"阿喀琉斯之踵"，华中农业大学的研究团队另辟蹊径，将PCV2的"外壳"改造成PRRSV的"通缉令海报"，研发出新型双价纳米疫苗，相关成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》。

研究团队采用杆状病毒表达系统生产重组蛋白，通过动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)验证病毒样颗粒形成，利用BALB/c小鼠和PRRSV阴性仔猪模型评估免疫效果。关键技术包括：1)基于AlphaFold2和SWISS-MODEL的蛋白质结构预测；2)将PRRSV表位插入PCV2 Cap蛋白特定区域(85-88/231-234aa)；3)流式细胞术分析T细胞亚群及细胞因子分泌；4)qPCR定量攻毒后组织病毒载量。

设计PCV2衣壳衍生纳米颗粒
通过结构分析锁定Cap蛋白表面非抗原性区域，将PRRSV的GP5B表位(37-45aa)与树突细胞结合肽(DCBp)融合插入85-88位点，同时在C端融合GP3I(61-72aa)和GP5IV(187-200aa)串联表位，构建出Cap-DS、Cap-DP、Cap-DE三种变体。结构预测显示改造后的蛋白仍保持天然构象，核心β-折叠区置信度>90%。

制备与结构表征
杆状病毒表达的四种重组蛋白(Cap-WT、Cap-DP、Cap-DS、Cap-DE)均能分泌至培养基，分子量25-35kDa，经离子交换和分子筛纯化后纯度>90%。电镜观察到直径约20nm的球形颗粒，DLS验证其粒径分布均一。

小鼠抗体反应
二次免疫后，Cap-DS组抗PRRSV中和抗体效价(11)显著高于Cap-DP(7)和Cap-DE(5)，而抗PCV2中和抗体效价各组相当(32-64)。ELISA显示所有改造蛋白均能诱导抗Cap、GP35和GP5B的特异性IgG。

细胞免疫应答
CCK-8检测显示疫苗组脾淋巴细胞增殖指数(SI)显著升高。流式分析发现CD4⁺
T细胞同时分泌IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2)，CD8⁺
T细胞中IFN-γ⁺
比例增加，且效应记忆T细胞(Tem)比例显著提升，血清IL-6/TNF-α水平与健康鼠无差异。

PCV2攻毒保护
Cap-DS组小鼠攻毒后脾、肺、肾病毒载量降至PBS组的1/100-1/10000，免疫组化显示组织PCV2抗原显著减少，脾淋巴细胞凋亡明显减轻。

仔猪PRRSV保护实验
Cap-DS免疫仔猪的中和抗体效价(38dpi达32)高于灭活苗组，攻毒后体温升高幅度降低1.5℃，血清病毒载量减少10-100倍，存活率(80%)优于灭活苗组(60%)和PBS组(40%)。肺组织病理显示Cap-DS组仅轻微充血，而PBS组出现严重间质性肺炎。

这项研究开创性地利用PCV2 VLPs作为抗原展示平台，首次实现单个纳米颗粒同时呈现PRRSV多个中和表位。Cap-DS疫苗的独特优势在于：1)安全无活病毒成分；2)诱导平衡的Th1/Th2和CTL应答；3)20nm粒径利于淋巴结富集；4)DCBp增强抗原提呈。该策略为多病原联合疫苗开发提供普适性方案，尤其适用于免疫抑制性病毒的共感染防控。未来可进一步拓展应用至其他病毒表位组合，或结合mRNA疫苗技术，构建更高效的"纳米疫苗工厂"。