基因组水平揭示志贺菌感染人类肠上皮的分子机制：基于类器官模型与转座子测序的系统研究

《Nature Genetics》：A scalable gut epithelial organoid model reveals the genome-wide colonization landscape of a human-adapted pathogen

本研究针对人类适应性病原体志贺菌(Shigella flexneri)的致病机制研究难题，创新性结合肠道类器官(enteroids/colonoids)感染模型与转座子插入测序技术(TraDIS)，首次绘制了志贺菌全基因组水平感染人类肠上皮的关键基因图谱。研究揭示了100余个染色体基因和38个毒力质粒(pINV)基因的感染贡献，发现tRNA修饰酶MnmE/G通过AGA/GGA密码子偏好性全局调控Ⅲ型分泌系统(T3SS)效应蛋白表达的新机制，为肠道病原体-宿主互作研究提供了可推广的技术框架。

　　

研究背景
志贺菌(Shigella flexneri)作为严格人类适应的肠道病原体，每年导致全球约1.6亿例细菌性痢疾。传统研究面临两大瓶颈：动物模型难以模拟人类生理特征，而肿瘤来源的细胞系(Caco-2等)存在转化特征偏差。尽管已知Ⅲ型分泌系统(T3SS)是志贺菌入侵的关键武器，但全基因组水平的感染机制图谱仍属空白。更关键的是，病原体如何协调毒力表达与代谢适应的分子开关尚未破解。

研究设计与技术方法
瑞典乌普萨拉大学Mikael E. Sellin团队联合德国亥姆霍兹研究所Lars Barquist团队，开发了基于基底向外(BO)极性肠道类器官的高通量感染模型，结合转座子插入测序(TraDIS)和贝叶斯零膨胀负二项分布(ZINB)统计模型，系统分析了43个平行感染实验。研究使用成人空肠(jejunal enteroids)和结肠(colonoids)来源的类器官，通过条形码竞争实验(barcoded consortium infections)验证关键发现，并采用质谱蛋白质组学解析tRNA修饰酶的调控网络。

主要结果

1. 可扩展的人类肠上皮感染模型建立
通过优化基底向外(BO)类器官悬浮培养体系，实现了志贺菌感染过程的实时成像。时间序列分析显示，感染3小时后出现细胞内菌落，6小时内经历4代增殖。通过野生型与△mxiD(T3SS缺陷株)共感染实验，证实该模型具有>60倍的动态范围。转座子库模拟表明感染瓶颈约2,000个细菌，据此设计43个亚库平行实验以确保基因组覆盖度。

2. 志贺菌上皮感染的全基因组图谱
ZINB模型分析85,000个转座子插入位点，鉴定出105个染色体基因(如外排泵acrAB-tolC、应激调控因子rpoS等)和38个pINV基因(包括T3SS结构基因和效应蛋白ipaA等)对上皮定植至关重要。值得注意的是，转运体突变体(△acrA等)在细胞内群体中完全消失，而脂多糖合成基因(waaO等)突变体反而富集，可能与膜锚定效率改变有关。

3. T3SS效应蛋白的微环境依赖性
条形码竞争实验揭示：IpgB1/B2(Rho GTPase激活因子)缺失导致基底面感染效率降低4倍，顶侧面(apical-out, AO)感染降低>10倍；IpaA(纽蛋白结合蛋白)在结肠类器官AO感染中缺陷最显著(15倍)，表明其参与顶侧入侵的独特作用。这种"几何依赖性"表型在多个供体来源类器官中重现，凸显人类模型的生理相关性。

4. tRNA修饰的全局毒力调控
TraDIS筛选发现tRNA修饰酶MnmE/G是上皮定植的关键因子。蛋白质组学显示，△mnmE/G突变体中25个pINV编码的毒力蛋白(包括VirB调控因子和IpaB等效应蛋白)显著下调。密码子分析揭示这些转录本富含AGA-Arg(0.19 vs 染色体0.04)和GGA-Gly密码子，而MnmE/G正调控U³⁴
修饰的tRNA识别这些稀有密码子。回补实验证实mnmE表达可完全恢复ipaA翻译和定植缺陷。

研究意义
该研究建立了"类器官-TraDIS"联合分析范式，首次揭示志贺菌感染人类肠上皮的基因组蓝图。发现tRNA修饰通过密码子偏好性调控毒力程序的新机制，为理解病原体适应与进化提供了新视角。技术层面，开发的ZINB模型有效克服了感染瓶颈对转座子筛选的干扰，该方法可推广至其他宿主-微生物互作研究。医学上，鉴定出的acrAB-tolC等靶点为抗感染药物开发提供了新方向。

创新性突破

1. 揭示MnmE/G通过U³⁴
   tRNA修饰协调毒力表达与代谢适应的分子开关
2. 建立首个涵盖人类空肠/结肠上皮的志贺菌感染基因图谱
3. 开发适用于复杂感染模型的贝叶斯统计框架(ZINB)
4. 发现IpaA在顶侧入侵中的独特作用，解释临床中结肠病变优势分布