c-di-GMP通过调控H-NS的DNA结合活性解除沙门氏菌基因沉默的分子机制

本研究针对沙门氏菌中第二信使c-di-GMP（环二鸟苷酸）是否通过结合全局调控蛋白H-NS（组蛋白样核苷酸结构蛋白）解除基因沉默这一争议问题，通过ITC（等温滴定量热法）、EMSA（电泳迁移率变动分析）和UV交联实验等多重验证，证实c-di-GMP特异性结合H-NS并抑制其DNA结合能力，其中K107A突变体丧失c-di-GMP响应性但保留DNA结合活性。该发现揭示了细菌表观调控的新模式，为病原菌毒力基因调控提供新靶点。

　　

在细菌的生存策略中，环境信号与基因表达的精准调控至关重要。沙门氏菌作为重要病原体，其毒力基因的表达常受全局调控蛋白H-NS的沉默控制。H-NS通过结合AT-rich DNA区域形成抑制性核蛋白结构，而第二信使分子c-di-GMP（cyclic di-GMP）近年被报道可能参与解除这种沉默，但其分子机制存在争议。西北农林科技大学的研究团队在《Nature Communications》发表的研究，通过多学科技术交叉验证，揭示了c-di-GMP直接结合H-NS并干扰其DNA结合的分子开关机制。

研究采用ITC定量结合亲和力、EMSA分析蛋白-DNA互作、UV交联验证分子结合，并以YcgR（已知c-di-GMP受体）作为阳性对照。沙门氏菌临床分离株的遗传学实验证实了体内调控效应。

主要研究结果

1. c-di-GMP与H-NS的特异性结合
   ITC数据显示野生型H-NS与c-di-GMP结合解离常数（K_d
   ）达微摩尔级，而突变体Y99A/K107A/T115A结合能力显著降低（63-178倍差异）。UV交联实验进一步验证了直接相互作用，排除了蛋白标签（17个N端非天然残基）的干扰效应。

2. DNA结合抑制的分子证据
   EMSA实验表明c-di-GMP剂量依赖性抑制H-NS与clpV启动子结合，而对照分子c-di-AMP/cGMP无此效应。结构分析推测C端8个非天然残基（LEHHHHHH）可能空间阻碍关键结合位点。

3. K107A突变体的功能验证
   K107A突变体保持野生型DNA结合活性（图1d-f），但对c-di-GMP无响应（图1a-c），证实K107为c-di-GMP结合的关键位点。

4. 生物学意义的拓展
   研究类比了分枝杆菌中Lsr2（异源沉默蛋白）作为c-di-GMP受体的新发现，提出"核蛋白-警报分子"互作可能是原核生物表观调控的保守模式。

结论与意义
该研究通过严谨的实验设计解决了领域争议：①确立c-di-GMP-H-NS互作的结构基础；②阐明K107在信号传导中的关键作用；③为理解细菌毒力基因的时空调控提供新范式。技术层面，研究通过对照实验排除了标签干扰（如凝血酶切割的His₆
-InvF不结合c-di-GMP），并强调全长蛋白实验的重要性。未来研究需进一步解析复合物晶体结构，并探索其他核蛋白是否具有类似传感机制。这一发现对开发针对细菌表观调控的抗菌策略具有潜在价值。