c-di-GMP与H-NS互作争议的终结：实验证据推翻其直接结合与基因沉默解除机制

本研究针对Li等人提出的c-di-GMP通过结合H-NS（一种原核生物全局转录沉默蛋白）解除基因沉默的假说，通过NMR（核磁共振）、ITC（等温滴定量热法）和EMSA（电泳迁移率变动分析）等实验证明c-di-GMP既不结合H-NS的DNA结合域（H-NSctd ），也不干扰其DNA结合能力，否定了c-di-GMP作为H-NS效应分子的观点，为细菌基因调控机制研究提供了关键纠偏。

　　

在细菌的生存策略中，H-NS（类核结构蛋白）扮演着"基因组守卫者"的角色，通过选择性沉默外源基因（如毒力基因和抗生素抗性基因）维持基因组稳定性。然而，细菌也需要适时激活这些基因以适应环境变化，这种精妙的平衡背后隐藏着复杂的调控机制。2023年，Li等人在《Nature Communications》提出惊人假说：细菌第二信使c-di-GMP（环二鸟苷酸）可直接结合H-NS的DNA结合域（H-NS^ctd
），通过竞争性抑制解除基因沉默，尤其能激活沙门氏菌中H-NS沉默的T6SS（VI型分泌系统）基因。这一发现若成立，将改写细菌环境适应的认知框架。

北京大学的研究团队Jiayu Wang、Hehan Wei和Bin Xia对此假说展开系统性验证。他们发现Li团队报道的0.3μM解离常数（K_d
）存在重大疑点：在pH 7.5条件下，NMR滴定显示即使10倍过量c-di-GMP也未能引起H-NS^ctd
的¹
H-¹⁵
N信号扰动，而阳性对照PilF^159-302
蛋白则表现出典型的结合特征。ITC实验进一步证实全长H-NS与c-di-GMP无相互作用，而H-NS^ctd
与靶DNA（3AT序列）的K_d
值为6.3±0.6μM（NMR）和7.6±0.5μM（ITC），与文献报道的H-NS-DNA相互作用强度一致。

关键实验技术
研究采用多维核磁共振（2D ¹
H-¹⁵
N SOFAST-HMQC/HSQC）分析蛋白-配体相互作用，等温滴定量热法（ITC）定量结合亲和力，电泳迁移率变动分析（EMSA）检测DNA结合活性，并结合突变体分析（Y99A/D101A/K107A/T115A）验证结构-功能关系。所有蛋白样本来源于大肠杆菌和沙门氏菌重组表达系统。

c-di-GMP不直接结合H-NS

通过比较大肠杆菌和沙门氏菌H-NS^ctd
（序列相似度98.1%）的NMR谱图，发现c-di-GMP、cGMP和c-di-AMP均未引起化学位移变化。阳性对照实验证实所用c-di-GMP试剂活性正常，且PilF^159-302
的HSQC谱图出现预期信号扰动（图1d）。ITC热力学曲线显示c-di-GMP与H-NS结合热流变化与背景噪声无异（图1e），而H-NS^ctd
-3AT DNA相互作用呈现典型的饱和结合曲线（图1f）。

c-di-GMP不影响H-NS的DNA结合能力
EMSA实验选用高AT含量（73.5-74.1%）的P_LEES
和P_yaiU
DNA片段，发现1μM H-NS即可完全阻滞DNA迁移，且80倍摩尔过量的c-di-GMP无论预混或后加均不改变复合物条带（图1g）。值得注意的是，Li团队报道的"非结合型"对照DNA_yaiU
（AT含量55.2%）在本研究中仍显示可检测的结合活性，暗示Li实验可能存在系统误差。

突变体分析揭示结构矛盾

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突变体表征'>
Li团队提出的c-di-GMP结合关键残基（Y99/D101/K107/T115）在H-NS^ctd
结构中空间分布不合理：T115侧链因α-螺旋阻隔无法与其他残基形成联合结合位点（图2d-e）。Y99A突变导致蛋白解折叠（图2a），T115A引起全局构象变化（图2c），而K107A突变使DNA结合K_d
从1.5±0.5μM升至5.3±1.6μM（pH 6.0），与Li报道的"K107A不影响DNA结合"结论直接矛盾。

标签问题的关键发现
研究指出Li团队使用的H-NS蛋白含有17个非天然N端残基（GSHMASMTGGQQMGRGS），而短至19肽的序列即可高亲和力结合c-di-GMP。相比之下，本研究的C端His-tag因柔性极高（RMSD达10.1?）且远离假定结合位点，不可能干扰实验结果。

结论与意义
该研究通过多维度实验证据否定了c-di-GMP作为H-NS效应分子的假说，指出：1）c-di-GMP与H-NS无直接相互作用；2）c-di-GMP不竞争性抑制H-NS-DNA结合；3）Li团队观察到的现象可能源于N端标签的干扰效应。这些发现纠正了细菌基因调控领域的重要认知偏差，为后续研究指明方向：T6SS等基因的c-di-GMP依赖性激活应寻找H-NS非依赖途径。论文对实验设计的严谨性提出警示——标签序列可能显著改变蛋白功能特性，为相关研究提供了方法学借鉴。